AAV在肝脏中的应用

慢病毒、腺病毒和腺相关病毒这三种病毒工具均能靶向肝脏，其中慢病毒特异性最差，由于它会随机整合到基因组中诱发插入突变，因此使用相对较少。腺病毒（Ad5亚型等）具有明显嗜肝的特性，常常被用于肝脏基因的递送表达，但是由于腺病毒会产生较强的免疫反应，引起明显的肝损伤，并对肝脏代谢等产生不可忽略的影响，因而腺病毒的使用也越来越受到局限。不过，并不是基于腺病毒的实验结果不可靠，具体问题需要具体分析。在不影响检测指标和相关信号通路的前提下，腺病毒是非常理想的靶向肝脏的载体。同时，腺病毒具有较大的装载容量，在递送较大的表达元件方面有非常明显的优势，但缺点是表达时间较短。其表达效果会随时间推移而逐渐下降，通常适合检测的高表达窗口期为注射后4-7天（图1）。

图1 腺病毒的注射效果（PNAS. January，2011）

在肝脏研究中，腺相关病毒的使用也越来越多。其中，有文章报道AAV8能够高效靶向肝脏表达。虽然也有其他血清型如AAV9在肝脏中的报道，但综合各方面数据分析，AAV8更适合在肝脏中长期表达（表1）。AAV8是从小鼠到临床试验都被广泛采用的血清型，但是AAV载体的一个主要弱点是装载容量比较有限。一般AAV载体能够表达的基因大小不宜超过2.5kb，否则将会极大影响包装效果。AAV感染表达的时间比较持久，一般认为可以持续6个月到1年的时间。但是如果细胞增殖较快，其表达也会随着分裂而不断丢失。

表1 静脉注射AAV 120天后体内各组织的分布情况（Molecular Therapy. October，2009）

一、Cre-loxp技术在小鼠肝脏中的应用
由于腺病毒高度嗜肝，几乎90%以上会感染肝脏，因此腺病毒可以作为肝脏特异性感染的有效载体。将Cre腺病毒（Ad-Cre）通过尾静脉注射入带有loxp小鼠体内，即可实现肝脏特异性表达并将目的基因敲除，从而快速获取肝脏特异性基因敲除小鼠（图2）。

图2 向loxp小鼠尾静脉注射Ad-Cre快速获取肝脏特异性敲除小鼠（The Journal of Biological Chemistry. October，2011）

二、CRISPR/Cas9技术在小鼠肝脏中的应用
通过腺病毒将CRISPR/Cas9系统相关元件（Cas9和sgRNA）注射入小鼠体内，可以实现在肝脏中特异性表达，并实现肝脏部位的特异性敲除。此方法比较适合检验活体实验（图3）。

图3 向野生型小鼠注射腺病毒介导的靶向PCSK9的CRISPR/Cas9（Circulation Research. June, 2014）

CRISPR/Cas9系统展现出了高效的基因编辑功能，不仅能够在同源模板存在下介导同源重组，可以被广泛用于制备Knock-in小鼠，而且能够修复突变的基因位点，用于基因治疗。
文献报道，一个命名为Fah5981SB的突变小鼠品系，其HT1基因在8号外显子处的最后一个碱基发生突变G—>A，导致RNA剪接时跨越了8号外显子，从而使编码的蛋白FAH截短不稳定，不能有效代谢酪氨酸，在肝脏中积累了有毒的代谢物，造成严重的肝损伤。研究人员利用流体力学进样的方法将CRISPR/Cas9元件和修复模板DNA递送到突变的小鼠肝脏，获得了0.25%肝细胞的精准修复。由于肝细胞能够增殖，这部分修复的细胞可以不断增殖而使得数目逐渐扩大，最终明显改善了肝损伤疾病（图4）。

图4 CRISPR修复肝脏缺陷的基因 （Nature Biotechnology. March, 2014）

X染色体遗传的高血氨症是由OTC基因突变引起的。该基因第四外显子最后一个碱基发生G—>A的突变，导致RNA剪接不能正常进行，使得mRNA和蛋白表达水平只有正常的5%。这种突变小鼠只能在基础饲料喂养下存活，在高蛋白饲料喂养下会产生高血氨症并致死。研究人员通过尾静脉注射将装载了SaCas9和sgRNA及修复突变位点模板的AAV8载体递送到基因缺陷小鼠中进行实验（图5）。

图5 AAV8递送的CRISPR系统用于修复小鼠OTC基因突变（Nature Biotechnology. March, 2016）

随后，研究人员检测发现，通过AAV8递送CRISPR/Cas9元件能够获取大约10%精准修复的肝细胞，大大高于此前通过其他递送方式治疗的效果。由此可见，AAV8对于肝脏递送非常高效，并能够帮助研究人员获取高效可靠的实验结果（图6）。

图6 AAV8递送的CRISPR/Cas9系统成功修复小鼠OTC基因突变并恢复OTC酶活（Nature Biotechnology. March, 2016）

和元生物拥有丰富的病毒载体库，包括CMV、CAG、EF1α等多种启动子及EGFP、mcherry、EYFP等多种荧光蛋白，满足不同实验的需求。