AAV在心脏中的注射及表达

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服务名称 :AAV在心脏中的注射及表达

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重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)是利用AAV2基因组DNA和不同血清型AAV衣壳蛋白包装成的病毒载体,一般标记为AAV2/N(N指衣壳血清型),有时仅标注血清型,如AAV9即AAV2/9。AAV因为免疫原性低,目前没有发现致病报道,并且表达持续时间较长,在实验室被普遍采用。现在对实验要求较高的科研工作者很多会推荐选用AAV载体。
在AAV的各种血清型中,AAV9是目前公认的高效特异性靶向心脏表达的病毒载体血清型(图1)。
图1 不同血清型AAV感染小鼠心脏组织。cTnT-EGFP包装进AAV衣壳血清型2,1,6,8,9后分别通过颈静脉注射1周龄小鼠,4周后检测小鼠心脏组织EGFP荧光 (Gene Therapy. January,2011)

AAV9经过系统注射(经血液循环)途径,优先感染心脏、肺的平滑肌、骨骼肌及其他脏器的平滑肌,也会瞬时感染肝脏,但在肝脏中的表达不持久。如果将AAV9递送到新生鼠中,病毒能够穿过血脑屏障,实现在大脑的中枢神经系统中高效表达(图2)。<和元生物可为您提供多种pAAV-EGFP病毒载体>
图2 AAV9-EGFP注射新生小鼠P4,1个月后冰冻切片检测各组织EGFP荧光(Cell Research. August,2016)

一、AAV注射方式介绍
AAV的注射方式,不同的文章中采用了不一样的注射方式。总体上,一般包括静脉注射、心腔内注射、心肌内定点注射、心包内注射(介于心肌与心包膜之间),其中静脉注射包括尾静脉注射、颈静脉注射、面部静脉注射等(图3)。
尾静脉注射和心腔内注射由于病毒流进血液循环,分布较均匀。心腔内注射需要结合主动脉嵌夹进行,由于开胸腔手术需要辅助呼吸,对手术操作要求较高。心肌内定点注射时每点注射2-5ul,效果是在注射的局部点附近表达较高,但扩散非常有限。总的来说,很多实验直接用尾静脉注射即可,但是可能需要较高剂量的病毒,如果用心肌内定点注射,即小量多点注射,可以达到很好的感染表达效果,但是后者操作技术难度略高,也需要花费更长的操作时间。
结合新生鼠(出生2-10天)注射效果比较来看,新生鼠注射表达效果大大优于成年鼠,消耗病毒剂量也相对较低。新生鼠的注射,一般根据实验室的条件来看,可以选择颈静脉注射、面部静脉注射和心腔内(左心室)注射,目的是将病毒导入血液循环中。
图3 AAV9-EGFP不同注射途径小鼠后心肌表达效果(Cell Research. August,2016)

二、心脏表达常用启动子
一些常用启动子如CMV、CAG、αMHC、cTnC等常被用于驱动在心脏组织中的表达。很多高效的启动子由于片段较大,如αMHC,仅用于转基因小鼠等实验,不适合装载在AAV载体上。通过查阅文献,我们发现一些小的启动子如CMV在心脏组织的表达能力比较强,特别对于大片段的驱动效果很明显,但是如果需要介导的目的基因在心脏中特异性表达,则推荐使用cTnT启动子,cTnT常被用于心肌的特异性表达,表达能力也很强(图3-6)。
图4 不同启动子驱动的心肌表达效果(Genetic Vaccines and Therapy. September,2008)

图5 CMV和CBA(chicken β-Actin)启动子驱动的EGFP (AAV9)表达效果(Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. June,2015)

图6 CMV和cTnT启动子驱动luciferase的表达(AAV6)(Gene Therapy. January,2011)

近些年出现的基因组编辑工具,如ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9,这些技术相比传统的同源重组来说作用效率更高。其中,以CRISPR/Cas9最受关注。CRISPR/Cas9的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与 tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成 tracrRNA/crRNA复合物,此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA,可以改造形成具有引导作用的sgRNA,以引导Cas9对双链DNA的切割。切割后造成剪切位点的DNA双链断裂(Double-strandbreak,DSB)。细胞内源修复机制随后启动进行修复,一种是非同源末端连接(Nonhomologousendjoining,NHEJ)修复途径,即断裂处直接连接或者会出现较高概率的插入缺失(indel)突变,导致编码CDS移码突变,蛋白往往提前终止,实现基因失活或者敲除(Knockout,KO)的目的;另一种是同源重组(Homologous recombination,HR),即存在修复模板情况下通过同源重组介导的修复,然后按照给定的模板进行修复,这种途径理论上可以设计模板而实现各种指定的突变(Knock-in,KI)。然而,两种修复途径在不同条件下突变效率可能差别非常大。NHEJ途径在多种细胞中发生的概率都比较高,用于受精卵可以高效获取KO小鼠,用于成体细胞可以容易获取KO细胞系。HR途径在大多数成体组织细胞中发生概率较低,相比较而言,此途径在干细胞、受精卵、早期胚胎中容易实现一些,包括细胞和小鼠的制备。
心脏一般认为是非增殖器官,同源重组概率极低。因此在心脏组织中应用CRISPR/Cas9方法几乎只能借助NHEJ修复途径得到移码突变。但是也可以通过同时使用2个sgRNA,使其切除一段DNA。如果sgRNA位于intron(intron大部分区域中的碱基插入缺失对exon剪接影响不大),几乎可以完美地删除exon,获取截短突变。
麻省理工大学张锋教授制作了第一例带有Cas9的Knock-in小鼠,即组成型表达和条件诱导型的Cas9 Knock-in小鼠,载体构建如下(图7)。
图7 Cas9 Knock-in小鼠构建示意图 (Cell. October,2015)
组成型表达Cas9蛋白的小鼠,从发育阶段开始会持续表达Cas9蛋白。持久高水平的表达Cas9蛋白会对细胞产生较强的毒副作用。研究中往往采取条件型Knock-in小鼠,搭配AAV病毒载体以表达Cre重组酶和根据目的基因设计的sgRNA,Cre通过重组切除Cas9蛋白前面抑制表达的loxp-STOP-loxp元件后,方可激活Cas9的表达,这样减少了发育积累过程中Cas9的毒副作用。并且启动Cre表达的区域局限于AAV感染表达的位点,能够实现组织定向的基因敲除。
同时,张锋团队通过分析SpCas9晶体结构,将这个DNA结合区域的一些正电荷氨基酸(Lys和Arg)突变成Ala后,筛选得到一些能够显著提高特异性的突变,并将升级版SpCas9命名为eSpCas9(1.0)和eSpCas9(1.1)。经过检测证明升级版SpCas9靶向切割DNA的突变效率也比较高。

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