稳定细胞株筛选

服务名称 ：稳定细胞株筛选实验服务

提供商 ：晶莱生物

规格 ：次

摘要：本实验使用过表达human Oct-4-EGFP的慢病毒感染HeLa细胞。该病毒的表达框为pLenti-CMV-Oct-4-EGFP-3FLAG-PGK-Puro： CMV启动子驱动Oct-4-EGFP基因的表达， 同时由PGK启动子驱动puromycin抗性基因的表达。在感染HeLa细胞72h后，通过加入并维持2μg/μL的puromycin杀死未被有效感染的细胞。从而在puromycin药物的维持下最终获得Oct-4-EGFP稳定表达的混合稳定株。
关键词：Oct-4-EGFP，稳定细胞株， HeLa，慢病毒

一、 实验原理
外源基因在细胞中的表达可分为两大类，一类是瞬时表达，一类是稳定表达（永久表达）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，虽然可以达到高水平的表达，但通常只持续几天。后者外源DNA整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期表达目的基因。建立稳定细胞株，一般是根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物对靶细胞进行筛选。最常用的抗性标记基因有潮霉素（hygromycin）、新霉素（neomycin）和嘌呤霉素（puromycin），常用Hygromycin B、G418和puromycin进行选择性筛选。传统的稳定株筛选方法需要通过外源基因的瞬时转染后对靶细胞进行筛选， 最终获得从单一细胞扩增起来的稳定细胞株， 该方法阳性率低，周期长，工作量大。慢病毒是一种RNA病毒，携带的外源基因在病毒感染细胞后需要逆转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组以后才能表达。 利用慢病毒必须整合到宿主基因组的特性来筛选稳定株的方法克服了传统方法的弊端，可以在短时间内获得高效率的稳定细胞株。筛选得到的细胞或者可稳定表达目的蛋白，用于蛋白的扩增和富集；或者得到稳定沉默特定基因的细胞株。

二、 实验目的
通过慢病毒感染配合药物筛选的方法获得稳定表达Oct-4-EGFP的HeLa稳定细胞株。

三、 实验步骤
实验共分以下3个主要步骤：
1. 细胞铺板
将HeLa细胞按30%的融合度接种到24孔板：
1) HeLa细胞配成1×105 cells/mL细胞悬液，待铺板。
2) 每孔铺500μL，即5×104 cells/well，铺1块24孔板。

2. 感染慢病毒
12~20h后感染慢病毒：
1) 根据公式计算病毒用量： （细胞数×MOI值/病毒原液滴度）×103=病毒用量（μL）。
2) 本实验中MOI取10，吸去与加入病毒体积相同培养基。
3) 每孔加2.5μL的polybrene (1mg/mL)，使polybrene终浓度达到5μg/mL。
4) 24h后换，弃去培养基后每孔加入500μL新鲜的培养基。

3. 稳定株筛选
1) 72h以后，加入终浓度2μg/μL puromycin。每隔2-3天换一次终浓度2μg/μL puromycin新鲜培养基。
2) 药物筛选约10天后，拍荧光照片。
3) 稳定细胞株冻存。

四、 实验结果
结论：从图1可以看到，在MOI为10条件下，HeLa的感染效率约为80%。根据图2，使用puromycin药物筛选10天后，表达目的基因的HeLa的比例在90%以上，且荧光亮度增强。Oct-4-EGFP稳定表达的HeLa细胞株筛选成功。

晶莱生物服务流程


晶莱生物实验服务项目

动物实验	细胞生物学	病理实验
消化系统模型	细胞培养	病理染色
胃酸分泌模型	普通细胞株	HE染色
脓毒症模型	细胞缺氧培养	油红O染色
胃溃疡模型	细胞培养+支架	番红固绿染色
胰腺炎模型	干细胞培养	Masson染色
肝纤维化模型	原代细胞分离/提取/培养	天狼猩红染色
DIO肥胖模型	细胞转染/病毒感染	PAS糖原染色
胆结石模型	Trans well共培养	阿利新蓝染色
结肠炎(UC)模型	细胞增殖	甲苯胺蓝染色
脂肪肝模型	细胞计数	尼氏染色
急性肝损伤模型	生长曲线测定	LFB髓鞘染色
免疫、代谢系统疾病模型	存活曲线测定	普鲁士蓝染色
骨质疏松模型	ccK-8增殖检测	VG染色
糖尿病模型	MTT增殖检测	EVG染色
高尿酸血症模型	CFSE检测增殖-流式检测	VonKossa染色
呼吸系统模型	BrDU检测-免疫荧光法	刚果红染色
肺纤维化模型	细胞凋亡	苏丹黑B染色
慢性肺阻塞模型	Annexin V/PI流式检测细胞凋亡	Trap染色
急性肺损伤模型	WB检测凋亡相关蛋白	抗酸染色
哮喘模型	透射电镜观察凋亡小体	革兰氏染色
肺栓塞模型	Tunel染色(POD法,DAB显色)	AB-PAS染色
支气管炎模型	Tunel(荧光法,含试剂盒)	亚甲基蓝染色
泌尿生殖系统模型	DNA ladder法	苯胺蓝染色
慢性肾衰模型	细胞周期	荧光 DAPI染色
急性肾衰模型	细胞显微计数	普鲁士蓝染色
肾间质纤维化模型	PI染色	间苯二酚碱性品红染色
肾结石模型	BrdU渗入法	银染
肾炎模型	免疫荧光染色	黑色素染色
子宫内膜异位症模型	PI流式检测细胞周期	镀银染色
心血管系统模型	细胞运动	PASM 六胺银染色
冠心病模型	Transwell检测细胞迁移	VG染色
心肌梗死模型	Transwell检测细胞侵袭	富尔根染色
心脏骤停模型	细胞划痕	亚甲基蓝染色
慢性心力衰竭模型	细胞克隆	碘-碘化钾染色
动脉粥样硬化模型	集落形成法/稀释铺板方法	Goldner三色法染色
白血病模型	软琼脂克隆法	PAS-萘酚磺S染色
高血压模型	毛细管克隆法	改良苯酚品红染色
神经系统模型	体外实验血管生成	网状纤维染色
脑卒中模型	磁珠分选细胞	β-半乳糖苷酶染色
栓塞性脑梗死模型	流式分选细胞	镀银染色
脑出血模型	开机费	movat五色染色
脑损伤模型	单色	维多利亚蓝染色
脊髓损伤模型	双色	免疫组化
帕金森模型	CBA多细胞因子流式检测	免疫组化预式
老年痴呆模型	组织/血液细胞制备	免疫组化正式
应激模型	组织单细胞制备	免疫荧光（石蜡-单标）
骨骼疾病模型	中性粒细胞提取	免疫荧光（石蜡-双标）
骨折模型	其他样本细胞制备（如血液等）	免疫荧光（石蜡-三标）
骨缺损模型	外周血PBMC分离	免疫荧光（冰冻-单标）
风湿免疫性关节炎模型	线粒体组学	免疫荧光（冰冻-双标）
骨关节炎模型	线粒体膜电位检测-流式法	制片前处理
五官疾病模型	线粒体膜电位检测-免疫荧光法	石蜡组织包埋
眼科疾病模型	线粒体ROS生物含量检测--流式	特殊包埋（细胞、材料、眼球等）
鼻腔疾病模型	线粒体ROS生物含量检测--免疫荧光	软化（肝硬化、皮肤结痂、植物等）
皮肤疾病模型	线粒体通透性转换孔（mPTP）	骨组织脱钙（小）
皮肤损伤模型	溶酶体免疫荧光法	骨组织脱钙（大）
肿瘤疾病模型	线粒体+溶酶体共定位	骨组织EDTA脱钙（小）
原位瘤模型	内质网	骨组织EDTA脱钙（大）
转移瘤模型	线粒体钙瞬时变化检测-流式	石蜡白片
皮下植瘤模型	ATP检测	细胞爬片
	ADP检测
	AMP检测
流式	DNA/RNA半定量检测	基因编辑工具
组织细胞悬液处理	pcr检测mRNA	合成（3保1）片段/质粒/引物合成
细胞处理	microRNA检测	质粒载体构建
血液标本处理	LncRNA表达量的检测	过表达腺病毒载体构建包装
细胞刺激培养	CirRNA表达量的检测	shRNA腺病毒载体构建包装
单色检测	凝胶电泳	过表达慢病毒载体构建包装
双色检测	基因合成	shRNA慢病毒载体构建包装
Annexin V/PI凋亡	＜300	过表达腺相关病毒载体构建包装
细胞周期	300-1,500	shRNA腺病毒载体构建包装
	1500 - 5000	稳转细胞株
	>5000
	特殊序列
ELISA	WB	qPCR
组织匀浆处理	蛋白提取及定量一	RNA抽提
ELISA（不含试剂盒）48T/kit	WB检测一（10孔膜/指标）	mRNA引物设计及合成
ELISA（不含试剂盒）96T/kit	灰度值分析及作图一（10孔膜/指标）	miRNA引物设计及合成
ELISA（含国产试剂盒）48T/kit	蛋白提取及定量二	LncRNA引物设计及合成
ELISA（含国产试剂盒）96T/kit	WB检测二（15孔膜/指标）	CircRNA引物设计及合成
	灰度值分析及作图二（15孔膜/指标）	mRNA RT-qPCR
		miRNA RT-qPCR
		LncRNA RT-qPCR
		CircRNA RT-qPCR

 

收费标准/服务周期/提供结果：
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