产品详情
文献和实验
相关推荐
服务名称 ：质粒DNA提取
提供商 ：上海古朵生物科技有限公司
标签： 质粒 DNA 提取 古朵生物 培养基注意：以下技术资料仅参考！
质粒DNA提取可以：（1）快速纯化质粒；（2）用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。
一、实验方法：
碱解法:
实验方法原理
质粒多为一些双链、环状的DNA分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是进行分子生物学实验操作，进行遗传工程改良物种等工作时最主要的DNA载体。
提取质粒的基本步骤分为三步：
①细菌的培养和质粒的扩增
②细菌菌体的裂解
③质粒DNA的纯化
SDS碱裂解法（试剂盒提取）:
实验方法原理
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
简明原理：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。
二、技术详解
质粒dna的提取是DNA技术中的必备实验技能。质粒DNA上携带的基因信息可经过基因表达实验后表现出相应的性状。质粒DNA的分离提取包括了培养细胞——收集——分离纯化三大步骤。
质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒dna上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。
从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。分离质粒DNA有三个步骤：
1、培养细菌使质粒扩增
2、收集和裂解细菌
3、分离和纯化质粒DNA
碱裂解法是较常用的提取的方法。其优点是得率高，适合于大多数的和菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。此法采取酸碱度高达Ph12.6的碱溶液使DNA发生变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，但仍然缠绕在一起不分开;而后者完全变性分，甚至出现断裂。因此，当加入中和液时，溶液Ph值恢复较低的近中性水平，此时， 质粒的两条小分子单链可迅速复性，恢复双链结构，但是主染色体DNA则无法复性。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。
在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：
共价闭合环状DNA(cccDNA)： 质粒的两条链没有断裂;超螺旋
开环DNA(ocDNA)： 质粒的一条链断裂;松弛的环状分子
线形DNA(lDNA)： 质粒的两条链均断裂;线性分子
三、材料、试剂及器具
1、材料
E.coliDH 5α(pUC 19 vector)
2、试剂
1)LB培养基
2)TE缓冲液
3)裂解液：溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ
4)酚：lvfang：异戊醇(25：24：1)
5)无水乙醇
6)70%乙醇
7)氨苄青霉素50mg/mL
器具
离心机、离心管、吸嘴
四、操作步骤
以1%比例把E.coliDH5α(含PUC18)接种于含氨苄青霉素(Amp)100μg/ml)的LB培养基中37℃振摇过夜(12-18h)
↓
取1.5ml培养物置离心管中
↓
10000rpm,离心1min，或4000rpm，离心5-10min
↓
去上清，倒扣干净吸收纸上吸干
↓
沉淀+100μL溶液Ⅰ
↓
加或不加入少量溶菌酶粉末;混匀，室温放置10min
↓
+加200μL溶液Ⅱ(新鲜配置)
↓
温和颠倒数次，混匀，冰上放置5min
↓
+150μl溶液Ⅲ→颠倒混匀，冰上放置15min
↓
离心12000rpm,15min
↓
上清液+等体积酚：lvfang：异戊醇振匀，12000rpm,离心5min
↓
小心转移上层至一新的离心管弃下层有机相和中层蛋白质
↓
上清液+2倍体积无水乙醇混匀，室温5min-10min
↓
12000rpm,5min-15min
↓弃上清
沉淀+1mL70%乙醇
↓
12000rpm离心5min-15min
↓
弃上清;并倒扣离心管使液体流干
↓+
自然干燥或真空抽干(看不到液滴为宜)
↓
加50μlTE缓冲液(20μg/mlRNaseA)溶解质粒粗取物
↓
-20℃保存
五、实验报告
检查、保存提取的质粒，要求记录实验现象并说明原因。
六、注意事项
1. Buffer S2、Buffer S3和Buffer W1含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。
2. 本试剂盒为AxyPrep 质粒DNA小量试剂盒，适合于从1-4 ml 细菌培养物中提取多至20 μg 高纯的质粒DNA。
上海古朵生物科技有限公司
实名认证
钻石会员
入驻年限：9年
