T细胞免疫组库（T cell Repertoire，TR）是指在任何指定时间，某个个体的免疫系统中所有功能多样性T细胞的总和。T细胞免疫组库测序（T cell Repertoire Sequencing, TR-SEQ）是以 T 淋巴细胞为研究目标，以PCR技术来扩增T细胞受体（TcR¹）的全基因序列，再结合高通量测序技术，全面评估免疫系统的多样性，深入挖掘免疫组库与疾病的关系。

T 细胞属于人体免疫细胞，它在肿瘤免疫治疗，自身免疫疾病以及移植耐受等方面发挥着重要的作用。每个 T 细胞都有自己特殊的 T 细胞受体 (TcR)，就像每一个细胞的身份证。对TcR测序分析可以准确监测我们免疫系统对疾病和治疗的反应，可以帮助科研者了解疾病与免疫系统的相互作用。

TcR 作用是识别抗原。T 细胞通过细胞表面的 TcR 来识别抗原呈递细胞带来的抗原，每一个 T 细胞含有一个特异的 TcR 用来识别相对特异的抗原。T 细胞通过 TcR 基因的重组从而达到其多样化 (Diversity) 的特点（如下图），并可识别各种抗原与之反应。

T 细胞受体是由α链和β链组成的（如下图）。TcR 转录子是通过基因组里的α链或β链上的 V,(D),J 基因随机排序出来的。抗原主要结合的区域叫 CDR3 (Complementarity Determining Region 3)，TcR 会经常出现核苷酸随机重组，所以每个人的 T 细胞受体就会有很高的多样性，这样就造成了 T 细胞受体的种类理论上会高达 10¹⁸ 种。所以对健康人和病人的 T 细胞受体测序是做好预防医学和个性化治疗的基础。

Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition. Janeway CA Jr, Travers P, Walport M, et al.

ImmuHub^TM通过基于第二代高通量基因测序技术为血液、骨髓或组织样本提供非常全面的 TcR 测序分析。我们会对测序后数据进行详细得生物信息学处理和数据分析，并且能保证每个样本的测序过程和分析结果在整个实验中的一致性，最大程度得减少实验结果误差。

ImmuHub^TM技术优势

1) 我们的检测分析更加全面准确，更少实验误差

• 很多实验室采取地是对 DNA 测序的方法，因为 gDNA 的提取与纯化相对简单，但如果通过 gDNA 来测序将会面临很多与准确性相关的问题。比如，TcR 上位于 C 区和 V-(D)-J 区之间有大量的内含子，这样会因为引物与不相关的内含子的非特异识别从而增加 PCR 扩增时候的背景杂质，导致引物的不必要消耗和增加结果误差。而我们能有效的提取 RNA 并且提供基于 RNA 的分析检测，这样除去了内含子，避免了以上提及的问题，还有提供的信息是基于表达的（有功能的）T 细胞受体 (TcR) 的优势。

• 大多数实验室的 PCR 扩增技术都是采用多重引物扩增的方法，多重引物的方法会影响样本备制时候的准确性。我们采用的是“单对”引物的方法，这样可以减少扩增时候的误差，同时能提供一个高精度的结果分析，也解决了多重引物法中混合引物扩增偏好性的问题。

• 多重引物扩增的方法是通过已知的 TcR 序列来设计的，在进行样本 备制的时候常常会忽略一些未知的序列，往往这些未知的序列有可能会是科研新发现的关键。我们的“单对”引物是能扩增 TcR 中的全 V-(D)-J 序列(包括 FR1-4 和 CDR1-3)，这样能有效的发现一些全新的外显子基因，使科研内容不仅仅局限于数据库里的已知基因。

2) 快速的检测分析

• 数以百万计的 TcR 序列都能够使用下一代高通量基因测序技术获得，并进行全面的数据分析。

• 深度的基因测序，并使用生物信息学分析算法对数据进行分析。

• 数据分析将会在收到样本的 8-12周内完成。

T 细胞受体(TcR)测序服务步骤

服务流程:客户提样本，通常为全血、骨髓、单个核细胞、分离后的T细胞、RNA/cDNA或者石蜡包埋的组织[FFPE]，送达公司实验室后，实验室根据样本的情况，进行血液或骨髓的T细胞分离→ RNA 提取→ cDNA 合成→第二代基因测序→生物信息学处理→数据分析和出图→临床信息分析（如下图）。 45个工作日后客户获得测序结果报告。

• 提取样本 RNA
我们将从客户送来的样本里提取客户所需要的T细胞亚型的 RNA，RNA 质量监控在样本备置中有着非常重要的作用，我们的每一步都会通过先进的设备，如 TapeStation (Agilent Technologies, Inc.)，对 RNA 和 cDNA 进行质量监控。如果样本质量不好，我们不会进行下一步，我们会联系客户或者使用其他方法获得更好质量的样本。

• cDNA 合成和基因扩增
我们合成 cDNA 将使用 5’ RACE PCR 技术来扩增 TcR 基因。

基于UMB的超强纠错
在原始RNA模板扩增前加入UMB（Unique Molecular Barcode，独立分子条形码）进行文库构建，可对后续PCR反应或测序过程中的错误进行有效纠正，还原真实的数据，完全杜绝PCR错误和测序错误，从而提高准确率。 模拟无PCR化测序，还原PCR之前的真实分子数量。

• 高通量测序
我们将使用 MiSeq^® (Illumina Inc.) 2 × 300 bp pair-end 方法来对 TcR 进行测序，保证 TcR 的全长序列都可获得。

• 数据分析
TcR 的测序数据将通过我们的生物信息学分析算法进行处理。

基本数据分析将会包含以下信息:

TcR种类数和FR1-4，CDR1-3 的序列
V-(D)-J-C gene ID 信息
每一个 V-(D)-J 序列的组合信息
多样性指数的计算、克隆群比例
绘制V/J基因表达的2D、3D图

深度数据分析：

TcR状态的统计、总结、谱系等

• 计算样本的统计总结：序列读数、平均克隆种类大小，无功能克隆种类数等

• 计算样本每个V和J基因的使用率，绘制基于标准分数（z-Score）的热力图（heatmap）

• 计算CDR3克隆种类长度的高斯分布，绘制前N个最高表达CDR3克隆的谱系图

• 绘制V-J基因配对频率图、3D森林图

• 基于CDR3基因长度，计算和绘制V基因的分布图

样本TcR多态性和克隆性评价

• 计算、比较样本间多样性和克隆性 (计算 Shannon、Simpson、Berger-Parker指数)

• 绘制样本多态性、克隆性图谱

样本间TcR克隆种类重合、共享分析 （overlap and sharing）

• 计算两个样本TcR克隆种类的共享情况，追踪同一个病人治疗前后克隆种类变化

• 绘制两个样本间克隆种类配对比较图

我们也将按照客户的要求提供更多的分析和不同的数据报告形式，数据结果将以电子文档的形式传送给客户。

TcR测序的部分科研应用方向

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【1.】 T细胞受体基因的专业术语起初是两个字母——“TR”，由国际人类基因命名委员会（HGNC）1999年审核通过。因而当提及到基因、基因座和链时，TR应该是最准确的描述。不过TcR是目前用得最广泛的。但是，大写的 ”TCR“ 缩写混淆了基因命名，应该避免。



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