全基因组甲基化测序 (WGBS)-欧易生物

全基因组甲基化测序 (WGBS)

WGBS（Whole-genome bisulfite sequencing）被视为甲基化测序的“金标准”
其原理是用 Bisulfite 处理，将基因组中未发生甲基化的 C 碱基转换成 U，
进行PCR扩增后变成T，与原本具有甲基化修饰的 C 碱基区分开来，再结合高通量测序技术
与参考序列比对，即可判断 CpG/CHG/CHH 位点是否发生甲基化
特别适用于绘制单碱基分辨率的全基因组 DNA 甲基化图谱

欧易特色

可靠的建库质量：多年文库技术积淀，具有丰富的样品处理经验和建库经验
完善的质控过程：可以提供整套质控分析，确保数据准确性
丰富的基础分析内容：从各个层面综合解析 WGBS 数据
更个性化的生物信息分析服务：成熟的生物信息分析团队，熟悉各种分析算法和软件；与客户充分互动，提供更多个性化分析思路和分析方案
可读性强的数据报告：提供多方面的数据及图形内容，同时撰写详细的软件使用手册，帮助客户更好地自行进行数据查看




推荐测序模式

Hiseq X Ten，PE150 30 X 基因组大小


数据分析内容

案例分享

案例一：利用全基因组甲基化测序绘制肿瘤微环境表观遗传特征谱

研究背景

实体瘤的发生与发展过程涉及肿瘤上皮细胞与其微环境之间的动态互作。目前，大部分关于肿瘤的表观基因组研究集中于上皮肿瘤细胞中。而有关维持肿瘤表型的肿瘤微环境的分子特征研究较少。

肿瘤相关成纤维细胞（CAF）是肿瘤微环境组成的一类主要细胞。CAF 可以促进前列腺癌细胞的迁移和增殖。有关 CAF 的表观基因组特征谱尚不清楚。

研究内容

文章利用 WGBS 技术，对肿瘤相关成纤维细胞 CAF 和非恶性前列腺成纤维细胞 NPF 进行甲基化检测，筛选两者间的差异甲基化区域 DMR，并进行 DMR 注释。结果显示 CAF 中的 DMR 富集发生于基因调控区域，通过与 RNAseq 的联合分析证明这些 DMR 会对基因的转录产生调控作用。另外 CAF 中 DMR 基因注释结果显示，DMR 富集到与肿瘤相关的信号通路。CAF 中筛选到的这些 DMR 可用于进行前列腺癌的诊断。

研究结果

1. 对 4 例前列腺癌组织分离得到的 CAF、4 例癌旁组织分离得到的非恶性前列腺成纤维细胞 NPF，分别进行全基因组甲基化测序（WGBS） ，平均每个样品测序深度 > 7x。结果显示 NPF 和 CAF 具有较为相似的甲基化谱。

2. NPF 和 CAF 对比显示，两组间存在 7534 个 DMR（差异甲基化区域），其中 CAF 具有更多的低甲基化区域（5038 个）。

3. 统计发现，CAF 中鉴别到的 DMR 富集于基因的调控区域，主要特征包括：大部分位于 CpG 岛区域之外；低甲基化 DMR 更多的位于启动子区域并且更靠近转录起始位点（TSS）；DMR 富集于增强子区域。

4. 对 DMR 进行基因注释，30% 的 DMR 富集到与肿瘤相关的信号通路。

5. 为了进一步研究调控区域 DMR 的作用，利用 RNAseq 进行了基因表达水平的检测，结果显示 445 个 MDR 与 220 个 DEG（差异表达基因）显著相关，其中与 162 个上调表达 DEG 相关的是低甲基化 DMR。并且这一相关性可以通过 BSP 和 RT-PCR 得到验证。

6. 对比前列腺癌上皮细胞和 TCGA 数据库中的前列腺癌组织中的甲基化数据，其中 50 个高甲基化 DMR 和 15 个低甲基化 DMR可以视为肿瘤特异性 DMR，可用于进行前列腺癌的诊断（AUC > 0.8）。

案例二：利用全基因组甲基化测序研究鱼类对环境变化的跨代适应

研究背景

环境对应生物个体的影响可以通过表观遗传学传递给后代个体。最近研究表明，当父母及其后代经历相同的环境变化时，后代可以适应气候的变化，这种跨代适应是否与表观遗传相关尚不清楚。

研究内容

文章对珊瑚礁鱼类多刺棘光鳃鲷暴露在不同水温下不同代际的个体，利用 WGBS 技术进行甲基化检测，研究温度适应在代际间的传递是否与表观遗传相关。结果显示，伴随温度的改变，共鉴别到 2467 个相关差异甲基化区域（DMR）和 1870 个相关基因。在这些基因中，193 个与跨代驯化表型性状、线粒体活性、氧消耗、血管生成等具有显著相关性。因此，这些基因可能与鱼类温度升高暴露后代的表型恢复过程具有关键作用。本研究证明了 DNA 甲基化与脊椎动物气候变化的跨代适应之间可能存在关联。

研究结果

1. 珊瑚礁鱼类多刺棘光鳃鲷暴露在高水温下（+3°C），对 4 个分组（control、暴露一代 Developmental、渐进暴露Step-wise、暴露两代 Transgenerational）每组各选择 4 个体的肝脏进行 WGBS 测序，测序深度 34-62x。同时进行转录组测序。

2. 与对照组相比，高水温暴露的鱼共有 2078 个 CpG 位点、389 个 CHH 位点、5 个 CHG 位点甲基化水平发生改变。

3. 与另外两个暴露组相比，连续高温暴露两代的 Transgenerational 组甲基化变化更为显著。

4. 渐进暴露 Step-wise 甲基化变化水平介于 Developmental 组和 Transgenerational 组之间。

5. 注释分析显示，2078 个 CpG DMR 与 1563 个基因相关，其中 251 个 DMR 与 NAS（净氧气消耗总量）显著相关。之前研究显示，高温下培养的鱼 NAS 会下降，但高温下跨代饲养的鱼 NAS 会恢复正常水平。

6. DMR 相关基因主要是一些参与能量平衡的，如胰岛素响应、营养代谢、线粒体活性等。

7. 与转录组联合分析显示，1563 个基因中只有 34 个表达量发生了显著改变，表明甲基化与基因表达相关性较弱。

参考文献

Ryu T, Veilleux HD, Donelson JM, et al. The epigenetic landscape of transgenerational acclimation to ocean warming. Nat Clim Change 2018; 8: 504-509. (IF: 19.181)

常见问题

1.为什么 WGBS 所得的 raw data 产量和 Q30 比例较全基因组重测序的低？
因为在 WGBS 建库过程中，非甲基化的 C 会转化为 U（测序过程中呈现为 T），因此 WGBS 文库处于碱基不平衡的状态（read1 中 C 含量极低、read2 中 G 含量极低）。而 Illumina 测序仪在 cluster 定位过程中会过滤较高比例的 cluster，使得 raw data 产量降低；另外由于 GC 含量较低，测序过程中质量值也较容易下降。

2. 哪些因素会影响结果？
样品 DNA 质量、Bisulfite 处理过程、测序深度、测序质量等都会影响到最终的结果。

3.怎样保证 Bisulfite 对 DNA 处理的完全性？
目前我们建立了标准实验流程，确保 Bisulfite 对 DNA 的处理达到生物信息分析要求。我们的标准实验流程是在以标准品DNA 和 H19 等基因位点的多个质量控制步骤下进行严格控制的。