简化基因组甲基化测序MethylRAD-Seq-欧易生物

简化基因组甲基化测序—Methyl RAD

Methyl RAD技术（Wang et al,Open Biol,2015)使用甲基化修饰依赖性内切酶
如FspEI、MspJL、LpnPI、AspBHI等，此类内切聘识别DNA上发生甲基化的胞晓淀
在识别位置的下游隔一定距离切割双链

若DNA双链具有中心对称甲基化状态
则可以切割产生一个固定长度的双链DNA片段

对酶切产生的标签建库测序
即可进行甲基化位点的定性和相对定量分析

欧易特色

文库构建简便快速，不经过片段大小选择，保证了实验的重复性
具有极强的灵活性，标签密度可控
标签长度一致，PCR扩增效率一致，测序深度均一
具有单碱基分辨率，可以做到甲基化位点的定性和相对定量分析

甲基化位点检测的假阳性率能够控制在0.50%以内（WGBS假阳性率在0.28%-0.50%)
提供标准和高级生物信息分析，可根据客户需求提供个性化数据分析
所需的样本DNA起始量较低
有参无参物种均可，既可用于未知甲基化位点的开发，也可用于不同样本间的甲基化位点的差异研究

推荐测序模式
Hiseq X-Ten , PE150·30Mreads/1G基因组大小



数据分析内容

标准数据分析



高级数据分析




案例分享

案例一：腭融合过程 EMT 机制调控研究

研究背景

腭突上皮细胞发生上皮-间质转化（EMT）是腭融合的关键环节，但是分子水平的调控机制，尤其是胚胎腭发育过程中的增强子甲基化的调控研究，仍不清楚。

研究内容

欧易生物携手汕头大学医学院第二附属医院，采用 Methyl RAD 技术对 6 个小鼠胚胎上鄂组织（实验组为全反式视黄酸处理；对照组为等量的玉米油处理）进行全基因组甲基化研究，通过筛选差异甲基化位点（CCGG 和 CCWGG）、GO 和 KEGG富集分析，发现腭融合过程调控 EMT 的 3 个基因的增强子甲基化水平发生变化，可作为唇裂治疗的新表观遗传标记。

研究结果

1. 6 个小鼠胚胎上颚组织共获得 800M clean reads，其中 325M reads 具有酶切位点，234M reads 能比对到参考基因组。检出的差异甲基化位点 CCGG 和 CCWGG 位点分别为 17299 个和 2363 个（p < 0.05, log 2 FC >1），CCGG 位点平均深度不低于29X，CCWGG 位点平均深度不低于 8X。

2. 聚类分析结果表明，差异甲基化位点在实验组的甲基化水平高于对照组的甲基化水平，另外，实验组和对照组的甲基化模式不同，存在明显的个体内和个体间甲基化差异。

3. 相比于 DNA 元件中的其他区域，大多数甲基化位点位于内含子和基因间区。

4. 筛选与腭部融合有关、并调控 EMT 的基因，并检测这些基因增强子的甲基化变化，结果 HDAC4、PDGFR 和 TCF7L2 的差异甲基化位点 CCWGG 位于内含子的非 CpG 岛。其中， HDAC4 增强子的差异甲基化位点发生了高甲基化，而 PDGFR 和 TCF7L2 增强子的差异甲基化位点发生了低甲基化，可作为腭融合治疗的靶标。

参考文献

Shu X, Shu S, Cheng H, et al. Genome-Wide DNA Methylation Analysis During Palatal Fusion Reveals the Potential Mechanism of Enhancer Methylation Regulating Epithelial Mesenchyme Transformation. DNA Cell Biol 2018; 37(6): 560-573. (IF: 2.236).

案例二：长牡蛎左右外套膜功能差异研究

研究背景

生物体的不对称发育一直是学界研究的焦点问题，TGF-β 通路的 Pitx2 基因在脊椎动物不对称器官的形成过程中发挥重要作用。但是，Pitx 基因在无脊椎动物的调控机制知之甚少。牡蛎的壳是由外套膜生物矿化形成的，左外套膜形成左壳，右外套膜形成右壳。长牡蛎的左壳通常比右壳大，左壳可以很牢固的附着到其它物体表面，而右壳却不能。左右壳功能的不同也就意味着左右外套膜分子的差异。

本研究在双壳贝类中开展了左右不对性的分析，创新性的对贝类对称器官的功能差异开展分析。

研究内容

欧易生物携手鲁东大学，对长牡蛎左、右外套膜分别进行了转录组测序、MethylRAD 全基因组甲基化检测、small RNA 测序（1 个左外套膜 vs 1 个右外套膜），结果发现 cgPitx 基因在右外套膜高表达，并且该基因启动子区的甲基化水平在左、右外套膜差异显著。small RNA 测序和 TGF−β 受体抑制剂实验，进一步证明 TGF−β 信号通路与牡蛎外套膜左、右不对称相关。

研究结果

1. 左外套膜和右外套膜的差异表达基因共 176 个，GO 和 KEGG 富集分析表明这些差异基因多集中在应激反应、代谢过程等生物学过程。同时，胞外区域等相关差异基因占比很大，表明左、右外套膜的胞外蛋白是不同的。6 个基因（包括 Pitx 基因）的定量 PCR 结果与转录组结果一致。

2. 发现与壳形成相关的基因（如 Perlucin、Nacrein1）在左、右外套膜上的表达量不同，表明牡蛎左壳和右壳的生物矿化机制不同；一些与信号转导或神经活动有关的基因（如 KCP、Temptin、cgPitx、Plasminogen）在右外套膜高表达，表明右外套膜对信号转导或神经活动更敏感；6 个过氧化物酶基因在右外套膜高表达，表明右壳在非特异性免疫防御的氧化应激方面可能起到更大的作用。另外，决定左右不对称的关键基因 cgPitx 在右外套膜高表达，且在桑椹胚、囊胚就表达，说明牡蛎的左右不对称在早期就已确定。

3. 采用 MethylRAD 技术分析牡蛎左、右外套膜的甲基化变化，491个 CCGG 位点甲基化水平存在差异，828 个 CCWGG位点甲基化水平存在差异。GO、KEGG 富集分析表明差异甲基化基因可能调控长牡蛎的能量代谢和信号转导。

4. 与右外套膜相比，cgPitx 基因启动子区的一个 CCGG 位点的甲基化水平显著高于左外套膜，该位点的焦磷酸测序结果与MethylRAD 结果相吻合。甲基化与转录组的联合分析发现，该位点的甲基化水平与基因表达呈正相关。

5. 本研究发现左、右外套膜 29 个差异表达的 miRNA，4 个靶基因 (TGFBR1, ACVR2B, SMAD2/3, SARA) 与 TGF−β 信号通路相关，且位于 Pitx 基因的上游，可能会影响 Pitx 基因的表达。表明 miRNA 也参与左、右外套膜的分化。

6. TGF−β 信号通路的抑制剂加入到牡蛎的不同阶段，长牡蛎由左、右不对称变为左、右对称，说明 TGF−β 信号通路对长牡蛎左、右外套膜的不对称具有重要作用。

参考文献：

Wei L, Xu F, Wang Y, et al. The Molecular Differentiation of Anatomically Paired Left and Right Mantles of the Pacific Oyster Crassostrea gigas. Mar Biotechnol 2018; 20(4): 425-435. (IF: 2.748)