EDU细胞增殖实验技术服务

服务名称 ：EDU细胞增殖实验技术服务

提供商 ：北京信生元生物医学科技有限公司

北京信生元是清华科技园的入园企业，聚焦生物医学领域，为您提供实验技术服务、标书润色、专利申报等多方面的服务，让您在事业上升途中有更多的时间陪伴家人和孩子。

 

我们实验技术服务的主要流程

实验原理

EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine)，中文名为5-乙炔基-2' -脱氧尿苷，是一种新型胸苷(胸腺嘧啶脱氧核苷，thymidine)类似物，EdU可以在DNA合成过程中替代胸苷掺入到新合成的DNA中。另一方面，EdU上的乙炔基能与荧光标记的小分子叠氮化物探针(如Azide Alexa Fluor 488、Azide Alexa Fluor 555、Azide Alexa Fluor 594、Azide Alexa Fluor 647等)通过一价铜离子的催化发生共价反应，形成稳定的三唑环，该反应非常迅速，被称作点击反应(Click reaction)，其反应原理见下图。通过点击反应，新合成的DNA会被相应的荧光探针所标记，从而可以使用适当的荧光检测设备检测到增殖的细胞。EdU即可以检测到细胞或组织样品中单个的增殖细胞，同时也可以对细胞或组织样品总体的细胞增殖情况进行定量检测。




EdU检测法中的点击反应(Click reaction)原理图
（荧光探针等标记的叠氮化物(Labeled Azide)与掺入到细胞DNA中的EdU，在铜离子的催化发生共价反应，形成稳定的三唑环，最终使细胞DNA标记上荧光探针或其它探针）

细胞增殖能力的检测是评估细胞活性、基因毒性和抗肿瘤药物效果等的基本方法。公认的最精确的检测细胞增殖的方法是直接检测细胞中DNA的合成。最初广泛使用的通过检测DNA合成来检测细胞增殖的方法是放射性标记核苷掺入法，如氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷([³H]thymidine)掺入法。但该方法由于有放射性污染并且很难实现单细胞检测而受到很大的限制，随后逐渐被基于抗体检测的BrdU(bromo-deoxyuridine)法所替代。BrdU法步骤繁多，且需要使用BrdU抗体，影响因素较多，稳定性比较差。并且由于BrdU法需要使用抗体，有时会和其它目的蛋白基于抗体的检测相互产生干扰。EdU法基于EdU掺入和后续的点击反应，无需使用抗体、操作便捷、检测灵敏度高，是一种在BrdU法基础上升级换代的新方法，将会逐步取代BrdU法。
MTT法、WST-1法、CCK-8法和CellTiter-Lumi™化学发光法都是基于细胞活性的细胞增殖检测方法，能检测到细胞的总体增殖效果，但无法检测到单个的增殖细胞。这几种方法尽管都不是检测DNA合成的，但被广泛用于替代[³H]thymidine掺入法。CFDA SE法基于细胞荧光示踪的原理能检测到单个的增殖细胞，但由于每增殖一次荧光减弱一半，在荧光显微镜下较难区分荧光减弱一半的细胞，检测灵敏度不是很高，通常仅适用于流式细胞仪检测。在进行科学研究时，上述这些基于细胞活性或CFDA SE的方法可以作为EdU法的补充性检测方法。  

• 一、材料和方法

1. 主要试剂和仪器
   1. 主要试剂
   2. 主要仪器

分类	中文名	英文名	品牌	货号
细胞培养	DMEM培养液	Medium hyclone	美国	SH30022.01B
	胎牛血清	Gibco	澳洲	16000-044
	青霉素/链霉素双抗溶液	Gibco	美国	15140-122
EdU检测	EdU细胞增殖检测试剂盒	EdU cell proliferation Test Kit	碧云天	C0088

分类	仪器名称	品牌	产地	货号/型号
仪器和耗材	高速冷冻离心机	SCILPGEX	美国	D3024R
	96孔细胞培养板	Corning	美国	3599
	1.5 ml离心管	Axygen	美国	MCT-150-C
	15, 50 ml离心管	Corning	美国	430791/430828
	倒置显微镜	尼康	日本	Nikon Ci-S
	成像系统	尼康	日本	Nikon DS-U3
EdU检测	酶标仪	Thermo Scientific	美国	VARIOSKAN FLASH

1. 实验方法
   1. 将细胞悬液以3×10³个/mL，100 μL/孔接种在96孔板中，在培养箱培养（37℃，5% CO₂）。
   2. 配制2X的EdU工作液：EdU浓度为20 μM。
   3. 将37℃预热的2X的EdU工作液(20 μM)，等体积加入孔中， EdU终浓度变为1X(10μM)。
   4. 细胞培养箱中孵育细胞2小时。
   5. 去除培养液，加入100 μL固定液(4%多聚甲*)，室温固定15分钟。
   6. 去除固定液，每孔用100 μL PBS清洗细胞3次，每次3-5分钟。
   7. 去除PBS，每孔用100 μL通透液(含0.3% Triton X-100的PBS)，室温孵育10-15分钟。
   8. 去除通透液，每孔用100 μLPBS清洗细胞1-2次，每次3-5分钟。
   9. 使用双蒸水配制Click Additive Solution和Click反应液，去除PBS后，每孔加入70 μL Click反应液，轻轻摇晃培养板以确保反应混合物可以均匀覆盖样品，室温避光孵育30分钟。
   10. 吸除Click反应液，用PBS清洗3次，每次3-5分钟。
   11. 酶标仪检测，测定吸光度。

 

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