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文献和实验
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服务名称 ：大鼠膝关节软骨细胞的原代培养
提供商 ： 威斯腾生物
SD大鼠，第三军医大学动物中心。
二、主要试剂及仪器
1、主要仪器
| 电热压力蒸汽消毒器(XDD) | （浙江绍兴医疗器械总） |
| 超净工作台 | （苏州净化设备公司） |
| TC2323型CO2恒温孵箱 | （美国SHEL LAB 公司） |
| 0.22um纤维素滤膜 | （德国BM公司） |
| 细胞培养瓶及细胞培养板(Costar) | （美国BD公司） |
| 光学显微镜(OLYMPUS CK-40) | （日本） |
| 倒置显微镜（OLYMPUS) | （日本） |
| 细胞计数板 | （上海医用仪器厂） |
| DMEM培养基 | （Gibco，美国） |
| 胰蛋白酶 | （Hyclone，美国） |
| 胎牛血清（FBS） | （Gibco/ Hyclone，美国） |
| PBS | （中山，北京） |
| 青霉素和链霉素 | （华北制药厂，中国） |
(1)PBS：用购自中山公司的PBS粉剂，每袋加ddH2O定容至1000ml，调pH7.2，高压灭菌消毒。
(2) DMEM细胞生长培养液：临用前根据需要加10%胎牛血清，1%的ITS，最后按1％体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U／mL和100 U／mL，置于4℃冰箱保存。
(3)抗生素：青霉素(80万U)和链霉素(100万U)在无菌操作台内以高压灭菌过的双蒸水溶解(分别加入4ml灭菌水/青霉素，5ml灭菌水/链霉素)，配制成20万u/ml分装，置于-20℃冰箱保存，临用时4℃解冻，注意尽量避免反复冻融，并使培养基最终浓度为100 u/ml。
(4)细胞冻存液：生长培养基（含20%胎牛血清）或100%胎牛血清，加入10%的DMSO混合均匀，置于4℃冰箱保存。
三、实验步骤
（1）取四周龄SD大鼠，颈椎脱臼法处死后立即用75%乙醇浸泡，移入超净工作台内，用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。
（2）碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，无菌条件下用灭菌消毒后的镊子和剪刀分离大腿腿骨，尽可能去除筋膜、肌肉和结缔组织；从关节处分离出软骨组织，将其剪成小于1mm3的组织块，用含双抗的PBS溶液冲洗两遍。
（3）软骨组织块静置5min，弃去上层液体及悬浮组织，往离心管中加3倍体积的0.25%胰蛋白酶，置入37℃的恒温摇床中，振荡消化15-20min；
（4） 4℃静置5min；弃上清，加入0.2%胶原酶II，置入37℃的恒温摇床中，振荡消化30～60min；
（5）加入生长培养基终止消化，反复吹打后依次通过200目滤网。收集滤液,1200rpm离心8min，弃上清，用DMEM完全培养基重新悬浮细胞, 放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；
（7）放入预置有薄骨片或盖玻片的培养板中进行培养。每3天更换培养液至第5天改为无血清培养液。免疫组化鉴定原代细胞。
四、细胞形态
膝关节软骨原代培养过程中，约24小时即可出现贴壁生长，细胞三角或多角形，生长缓慢，培养3-5天进入快速增殖期。
五、注意事项：
细胞培养一定要保持工作区的无菌清洁，先用紫外灯和臭氧杀菌1h，然后通风30min，操作前需要换细胞间专用拖鞋，双手带上一次性橡胶手套并用75%乙醇消毒，穿上实验服，戴上一次性口罩和帽子，整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。
六、威斯腾生物服务流程：
| 分子生物学类 | 蛋白质与免疫学 | 动物实验 |
| 实时荧光定量PCR | 单克隆抗体制备 | 帕金森疾病模型 |
| 免疫共沉淀（Co-IP） | 多克隆抗体制备 | 抑郁症动物模型 |
| ELISA（酶联免疫吸附法）技术 | Western-blot 实验服务 | 脊髓损伤模型 |
| 生化指标检测 | 蛋白双向电泳实验服务 | 脑外损伤模型 |
| 双荧光素酶报告基因检测 | 原核蛋白表达纯化 | 骨神经损伤模型 |
| 染色质免疫共沉淀（ChIP） | 真核蛋白表达纯化 | 心肌缺血模型 |
| GST pull Down | ITRAQ定量蛋白质组学 | 心力衰竭模型 |
| SLAC蛋白组学 | 肺动脉高血压动物模型 | |
| 高血压模型 | ||
| 病毒包装服务 | 实验课题整体外包 | 粥样动脉硬化模型 |
| 过表达/干扰慢病毒包装纯化 | 整体课题外包 | 大脑中动脉阻塞模型 |
| 过表达/干扰腺病毒包装纯化 | 细胞整体实验外包 | 慢性之气管炎模型 |
| 逆转录病毒包装纯化 | 动物整体实验外包 | 过敏性哮喘模型 |
| 腺相关病毒包装纯化 | 肺炎大鼠模型 | |
| 肝炎-肝硬化-肝癌模型 | ||
| 蛋白芯片 | 原代细胞培养 | 肝纤维化模型 |
| 细胞因子芯片 | 骨髓间充质干细胞培养 | 胆结石模型 |
| 生长因子芯片 | 脂肪干细胞培养 | 急性胰腺炎模型 |
| 信号通路磷酸化水平检测芯片 | 心肌成纤维细胞培养 | 急性肾衰竭模型 |
| BioPlex悬浮芯片 | 软骨细胞培养 | 体内血栓模型 |
| 生长因子芯片 | 血管内皮细胞培养 | 关节炎模型 |
| 炎症因子芯片 | 神经元细胞培养 | I型和II型糖尿病模型 |
| 血管生成因子芯片 | 内皮组细胞原代培养 | 裸鼠成瘤 |
| 凋亡因子芯片 | 基因编辑动物 | |
| 趋化因子芯片 | 电生理相关服务 | 动物整体实验服务 |
| HuProt TM 20K人类蛋白组芯片 | 膜片钳实验 | |
| 细胞生物学 | 高通量测序 | 代谢组学 |
| 细胞原代培养 | mRNA测序 | 气相色谱GC/MS |
| MTT检测 | LncRNA测序 | 液相色谱LC/MS |
| 细胞凋亡检测 | 全基因组测序 | 核磁共震NMR |
| 细胞周期检测 | RNA-Seq测序 | |
| 细胞克隆形成实验 | 外显子测序 | 影像学相关实验 |
| Transwell细胞迁移/侵袭 | 16s扩增子测序 | Micro-CT |
| 流式分选 | Small RNA测序 | 小动物活体成像 |
| CCK8/XTT检测 | 宏基因组测序 | 核磁共振 |
| 台盼蓝检测细胞活性 | 单细胞测序 | PET-CT |
| 药物筛选细胞学实验 | circleRNA测序 | |
| 细胞粘附性检测 | 甲基化测序 | 基因编辑动物 |
| 细胞划痕实验 | 条件性敲除小鼠/大鼠 | |
| 细胞生物学整体实验 | 全基因敲除小鼠/大鼠 | |
| 细胞成管实验 | ||
| 病理检测 | CRISPR/Cas9细胞敲除/敲入 | 基因芯片 |
| 扫描电镜 | 基因定点突变细胞系 | LncRNA芯片 |
| 透射电镜 | 单基因敲除细胞系 | miRNA芯片 |
| HE染色 | 多基因敲除细胞系 | mRNA芯片 |
| 免疫组化 | 目的基因敲入细胞系 | 甲基化芯片（限人和小鼠来源样本） |
| Tunel（原位末端凋亡法）检测 | 报告基因敲入细胞系 | SNP芯片（限人和小鼠来源样本） |
| 激光共聚焦 | miRNA/LncRNA敲除细胞系 | |
| 免疫荧光 | ||
| Masson染色 | CRISPR/Cas9动物敲除/敲入 | 科研方案设计与SCI相关服务 |
| 原位杂交 | 基因敲除大鼠/小鼠 | 科研文献论著翻译 |
| 荧光原位杂交 | 基因敲入大鼠/小鼠 | SCI论文翻译润色服务 |
| 特殊染色（PSA、茜素红、阿尔新蓝等） | 临床实验/科研实验设计方案指导 | |
| 行为学检测 | 药物筛选服务项目 | 药效学评价 |
| 水迷宫实验 | 高通量自动药物筛选平台 | 神经系统药物药效学评价 |
| 旷场实验 | 细胞高内涵药物筛选平台 | 抗肿瘤药物药效学评价 |
| 重复性刻板行为检测 | 蛋白质组学靶标研发平台 | 心血管系统药物药效学评价 |
| 动物跑台检测 | 分子药理研究平台 | 泌尿系统药物药效学评价 |
| 强迫游泳 | 生物膜片钳药物筛选平台 | 内分泌系统药物药效学评价 |
| 常规药物体外筛选 | 抗炎免疫药物药效学评价 |
【本平台合作项目】
分子生物学、细胞生物学、基因敲出/入、模式动物、SPF动物保种、病理学检测、免疫学检测、影像学检测、原代培养、细胞药筛、CRISPR/Cas9基因编辑、基因芯片、高通量测序、蛋白组学、代谢组学、高通量高内涵筛选、药效学评价、药理毒理学实验、慢病毒包装与稳转株建立、SiRNA与纳米载药、ChIP、CO-IP、生物信息学分析、知识产权服务！
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