小鼠海马神经元细胞原代分离培养（威斯腾生物-中关村生物医学研发检测共享平台！）

服务名称 ：小鼠海马神经元细胞原代分离培养

提供商 ： 威斯腾生物

新生24h 内清洁级C57小鼠若干，客户提供。
二、主要仪器及试剂
1、主要实验仪器

80/150/200目不锈钢细胞筛	上海生工，中国
电热压力蒸汽消毒器	浙江绍兴医疗器械总厂
超净工作台	苏州净化设备公司
二氧化碳培养箱	三洋（Sanyo），日本
电热恒温鼓风干燥箱	上海跃进医疗器械厂
低速台式离心机	上海安亭科学仪器厂
倒置显微镜	OLYMPUS，日本
照像系统	OLYMPUS，日本
移液器	Eppendorf，德国
细胞计数板	上海医用仪器厂
细胞培养瓶及细胞培养板	Costar，美国
各种型号塑料离心管、移液枪头和冻存管	Axygen，美国
0.22um纤维素滤膜	MILLIPORE，美国
0.45um混合纤维素滤膜	MILLIPORE，美国
剪刀、镊子	中山恒基达医疗器械

2、主要试剂

B27	Gibco，美国
DMEM-F12培养基	Gibco，美国
Neurobasal A medium	Gibco，美国
胎牛血清	Gibco，美国
胰蛋白酶	碧云天，中国
PBS	北京中杉
青霉素-链霉素溶液（100X）	碧云天，中国
DMSO	Amresco，美国
L-多聚赖氨酸	sigma，美国
阿糖胞苷（Ara-C）	Pharmacia，美国
L-谷氨酰胺	Gibco，美国
台盼蓝	Sigma，美国
Aβ42	客户提供

3、主要试剂配制
（1）PBS磷酸盐缓冲液： PBS粉剂每袋加ddH₂O定容至1000mL，调pH7.2，121℃，30min高压灭菌，44℃冰箱保存。
（2）接种液的配制：按胎牛血清与DMEM-F12培养液体积比1：10，无菌条件下加入1%体积分数的双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 U/mL，置于4℃冰箱保存。
（3）神经细胞维持培养液（无血清培养液）的制备 ：Neurobasal；2%B-27；1% 0.5mmol/L L-谷氨酰胺；1%青链霉素。换液前 3h 配制，置于4℃备用。
（4）0.01% L-多聚赖氨酸溶液的配制：称量 10mg L-多聚赖氨酸，溶于 100ml 灭菌去离子水，0.22μm 正压滤器过滤分装，-20℃保存。
（5）阿糖胞苷溶液的制备：
a. Ara-C 储存液：称量 Ara-C 0.01g，溶于25mL去离子水中，即成 1.4mmol/L储备液。0.22μm 正压滤器过滤分装，置-20℃冰箱储存。
b. Ara-C 工作液： Ara-C储存液与无血清培养基以1:3 体积比配制成浓度为100µg/mL 的溶液。使用时按照培养液与100µg/mL的Ara-C体积比40:1 稀释，即Ara-C的工作浓度为2.5µg/mL。
（6）0.4%台盼蓝溶液的配制：台盼蓝4 g，PBS少许（研磨），PBS定容至100mL，滤纸过滤，室温保存。
（7）四噻唑兰溶液配制：MTT50mg，PBS10mL磁力搅拌30min，0.22µm 微孔滤膜过滤分装，4℃保存，2周有效。
三、细胞操作实验方法
1、小鼠海马神经元细胞的原代分离培养
（1）培养板的包被
用0.01%的 L-多聚赖氨酸溶液包被培养板和小玻片，37℃恒温孵育 4h 或常温过夜。
吸弃 L-多聚赖氨酸溶液，灭菌去离子水漂洗培养孔及小玻片，晾干备用。
2、小鼠海马神经元细胞的分离及培养
（1）75%（体积分数）酒精消毒新生24h内的健康C57小鼠，在无菌条件下脱颈处死，剪开头皮及颅骨，取出脑组织，置于盛冷的pH7.2，无钙、镁的D-Hank's液的平皿中（下置冰袋）。
（2）无菌分离海马组织。保持脑组织背面朝上，在镜下小心翻开大脑皮质，暴露海马，用眼科剪或尖镊分离海马周围组织，取出放入盛有D-Hank's液的平皿中。
（3）用虹膜剪将组织剪切成1mm³左右的组织块，0.125%胰蛋白酶消化，37℃作用 20min，期间振摇 2~3 次。
（4）弃去上清液，加入完全接种液终止消化，漂洗2次。巴斯德吸管轻轻吹打 20次，制成细胞悬液，静置 2min。
（5）悬液收集于新的离心管，离心（1000rpm，10 min，4℃），弃去上清液。加入完全培养液重悬，200 目不锈钢网过滤。
（6）将滤液进行台盼蓝拒染试验,血细胞计数板镜下计数。以 8.0 ×10⁴至 1.0 ×10⁵/mL的密度将细胞以400µL/孔接种到预先用L-多聚赖氨酸包被的24孔培养板或 100µL/孔接种 96 孔培养板。
（7）置 37℃、5%CO₂培养箱培养 4-6h，全量更换为无血清培养液。
（8）体外培养第3d，加入Ara-C-工作液，以抑制非神经细胞过度增殖，作用 24 h后吸出。
（9）此后每 3d半量换液1次 , 体外培养第 7～21d的细胞用于实验。
四、无菌操作注意事项
细胞培养一定要保持工作区的无菌清洁，先用紫外灯和臭氧杀菌1h，然后通风30min，操作前需要换细胞间专用拖鞋，双手带上一次性橡胶手套并用75%乙醇消毒，穿上实验服，戴上一次性口罩和帽子，整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。
五、威斯腾生物服务流程

六、威斯腾生物服务项目

分子生物学类	蛋白质与免疫学	动物实验
实时荧光定量PCR	单克隆抗体制备	帕金森疾病模型
免疫共沉淀（Co-IP）	多克隆抗体制备	抑郁症动物模型
ELISA（酶联免疫吸附法）技术	Western-blot 实验服务	脊髓损伤模型
生化指标检测	蛋白双向电泳实验服务	脑外损伤模型
双荧光素酶报告基因检测	原核蛋白表达纯化	骨神经损伤模型
染色质免疫共沉淀（ChIP）	真核蛋白表达纯化	心肌缺血模型
GST pull Down	ITRAQ定量蛋白质组学	心力衰竭模型
	SLAC蛋白组学	肺动脉高血压动物模型
		高血压模型
病毒包装服务	实验课题整体外包	粥样动脉硬化模型
过表达/干扰慢病毒包装纯化	整体课题外包	大脑中动脉阻塞模型
过表达/干扰腺病毒包装纯化	细胞整体实验外包	慢性之气管炎模型
逆转录病毒包装纯化	动物整体实验外包	过敏性哮喘模型
腺相关病毒包装纯化		肺炎大鼠模型
		肝炎-肝硬化-肝癌模型
蛋白芯片	原代细胞培养	肝纤维化模型
细胞因子芯片	骨髓间充质干细胞培养	胆结石模型
生长因子芯片	脂肪干细胞培养	急性胰腺炎模型
信号通路磷酸化水平检测芯片	心肌成纤维细胞培养	急性肾衰竭模型
BioPlex悬浮芯片	软骨细胞培养	体内血栓模型
生长因子芯片	血管内皮细胞培养	关节炎模型
炎症因子芯片	神经元细胞培养	I型和II型糖尿病模型
血管生成因子芯片	内皮组细胞原代培养	裸鼠成瘤
凋亡因子芯片		基因编辑动物
趋化因子芯片	电生理相关服务	动物整体实验服务
HuProt TM 20K人类蛋白组芯片	膜片钳实验
细胞生物学	高通量测序	代谢组学
细胞原代培养	mRNA测序	气相色谱GC/MS
MTT检测	LncRNA测序	液相色谱LC/MS
细胞凋亡检测	全基因组测序	核磁共震NMR
细胞周期检测	RNA-Seq测序
细胞克隆形成实验	外显子测序	影像学相关实验
Transwell细胞迁移/侵袭	16s扩增子测序	Micro-CT
流式分选	Small RNA测序	小动物活体成像
CCK8/XTT检测	宏基因组测序	核磁共振
台盼蓝检测细胞活性	单细胞测序	PET-CT
药物筛选细胞学实验	circleRNA测序
细胞粘附性检测	甲基化测序	基因编辑动物
细胞划痕实验		条件性敲除小鼠/大鼠
细胞生物学整体实验		全基因敲除小鼠/大鼠
细胞成管实验
病理检测	CRISPR/Cas9细胞敲除/敲入	基因芯片
扫描电镜	基因定点突变细胞系	LncRNA芯片
透射电镜	单基因敲除细胞系	miRNA芯片
HE染色	多基因敲除细胞系	mRNA芯片
免疫组化	目的基因敲入细胞系	甲基化芯片（限人和小鼠来源样本）
Tunel（原位末端凋亡法）检测	报告基因敲入细胞系	SNP芯片（限人和小鼠来源样本）
激光共聚焦	miRNA/LncRNA敲除细胞系
免疫荧光
Masson染色	CRISPR/Cas9动物敲除/敲入	科研方案设计与SCI相关服务
原位杂交	基因敲除大鼠/小鼠	科研文献论著翻译
荧光原位杂交	基因敲入大鼠/小鼠	SCI论文翻译润色服务
特殊染色（PSA、茜素红、阿尔新蓝等）		临床实验/科研实验设计方案指导
行为学检测	药物筛选服务项目	药效学评价
水迷宫实验	高通量自动药物筛选平台	神经系统药物药效学评价
旷场实验	细胞高内涵药物筛选平台	抗肿瘤药物药效学评价
重复性刻板行为检测	蛋白质组学靶标研发平台	心血管系统药物药效学评价
动物跑台检测	分子药理研究平台	泌尿系统药物药效学评价
强迫游泳	生物膜片钳药物筛选平台	内分泌系统药物药效学评价
	常规药物体外筛选	抗炎免疫药物药效学评价

【本平台合作项目】
分子生物学、细胞生物学、基因敲出/入、模式动物、SPF动物保种、病理学检测、免疫学检测、影像学检测、原代培养、细胞药筛、CRISPR/Cas9基因编辑、基因芯片、高通量测序、蛋白组学、代谢组学、高通量高内涵筛选、药效学评价、药理毒理学实验、慢病毒包装与稳转株建立、SiRNA与纳米载药、ChIP、CO-IP、生物信息学分析、知识产权服务！