蛋白抽提-亚细胞结构真核膜蛋白提取试剂盒

保存条件 ：4℃

保质期 ：一年

库存 ：大量

供应商 ：博士德生物

规格 ：Kit

产品货号：AR0155

产品名称：亚细胞结构真核膜蛋白提取试剂盒

产品价格：600元/kit

产品规格：蛋白抽提液A液 30ml

蛋白抽提液B液 100ml

保存条件：4℃保存，一年有效

产品说明：该试剂盒提供优化的缓冲液和试剂，用来高效地抽提哺乳动物组织和细胞的膜蛋白。以温和的裂解液为基础富集膜蛋白。首先，细胞以温和裂解液裂解，再添加裂解液以溶解膜蛋白在37℃下孵育，通过水相和去污相分离，此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。利用此性质可提取膜蛋白。试剂盒所抽提出的膜蛋白可用于免疫印迹，二维电泳和酶活性分析等多种检测方法。

使用方法：

注意: 抽提蛋白前，将膜蛋白抽提试剂A.B置于冰浴上（抽提试剂B在室温会分层）.提取试剂A.B在使用前数分钟内需加入酶抑制剂（博士德产品货号为AR1178，AR1182，AR1182）。

细胞：

1.对于贴壁细胞:去除培养液，用预冷的PBS 洗一遍，并用细胞刮刮下细胞（最好不用胰酶消化，可能降解蛋白）。3000g 离心5min收集细胞，尽量吸尽上清，留下细胞沉淀备用。

2.对于悬浮细胞:3000g 离心5min收集细胞，尽量吸尽上清，留下细胞沉淀备用。

3.用适量预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，4℃，3000g离心5min沉淀细胞，弃上清。

4.加入预冷的蛋白抽提液A重悬细胞沉淀（约为细胞沉淀体积的5-10倍），在冰上孵育10-15min，期间取出震荡数次。

5.添加1-3倍体积的预冷的蛋白抽提液B液，冰上孵育1小时，期间取出震荡数次。

6.在4℃ 10000g离心10分钟，将上清转移至新的离心管中，弃沉淀，上清在37℃环境下孵育10min以分离膜蛋白，为了提高膜蛋白分离效率，可以适当延长孵育时间至20分钟。

7.37℃的环境下10000g离心10分钟（如分层不明显，可以加大离心力至12000g以及离心时间），以将含疏水膜蛋白的去污剂相从中分离出来，以最快的速度将上层的水相弃去（样品上下分层，下层含膜蛋白）。

8.为提高膜蛋白的纯度（此时膜蛋白得量也会相应降低），可将下层的含膜蛋白的去污相溶于预冷的PBS中，重复6.7步骤2-3次。

9.将分离的膜蛋白溶液冷冻分装保存，可以用于膜蛋白的分析。

组织：

1.手术切除的组织块（组织块尽量不含脂肪组织和结缔组织等非目的组织）迅速置于预冷的PBS中，漂洗数次，将组织称量后切成几个较小的组织块放入组织匀浆器中，加入预冷的抽提液A(按照0.1g组织加入1ml抽提试剂A),至于冰上匀浆，匀浆后镜检，细胞破碎率不小于90%，同时没有明显的组织小块。

2.在冰上孵育10-15分钟，期间取出震荡数次。

3.添加1-3倍体积的预冷的蛋白抽提液B液，冰上孵育1小时，期间取出震荡数次。

4.在4℃下10000 g离心10分钟，将上清转移至新的离心管中，弃沉淀，上清在37℃的环境下孵育10分钟以分离膜蛋白，为了提高膜蛋白分离效率，可以适当延长孵育时间至20分钟。如离心分层不明显，可增加离心转速至12000g和离心时间。

5.37℃的环境下10000g离心10分钟（如分层不明显，可以加大离心力至12000g以及离心时间），以将含疏水膜蛋白的去污剂相从中分离出来，以最快的速度将上层的水相弃去（样品上下分层，下层含膜蛋白）。

6.为提高膜蛋白的纯度（此时膜蛋白得量也会相应降低），可将下层的含膜蛋白的去污相溶于预冷的PBS中，重复4.5步骤2-3次。

7.将分离的膜蛋白溶液冷冻分装保存，可以用于膜蛋白的分析。

【SDS-PAGE电泳操作步骤】

1.每100ul膜蛋白提取混合物加入0.9ml丙酮，冰浴20min，10000g离心20min。

2.弃上清，沉淀置冰上干燥10min(敞开离心管盖)，加入适当体积的上样缓冲液溶解，沸水浴3-5min，如还有难溶物，可取上清上样电泳，也可以加入一定量的Urea，Thiourea，NDSB-20等试剂有助于膜蛋白完全溶解。

注意事项：

1.所有试剂需预冷后使用,以保证蛋白的完整性。

2.抽提试剂B在低温下为浑浊状态，请于此温度下混匀后吸取加入样本中。

3.如果需要，请在实验前，将酶抑制剂加入抽提试剂中。

4.对于提取的膜蛋白，建议使用BCA蛋白定量试剂盒进行定量。