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文献和实验
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保存条件 ：-20℃
保质期 ：一年
英文名 ：In Situ Cell Apoptosis Detection Kit Ⅳ (FITC+POD)
库存 ：大量
供应商 ：博士德生物
规格 ：20T
产品编号：MK1024
产品价格：1300元/盒(20T)
产品价格：1300元/盒(20T)
保存期：十二个月。-20℃冷冻保存。
工作原理：在机体内部随时都在发生着细胞的死亡。传统上用显微镜来观察细胞的死亡，其特征为核染色质的浓缩及碎片的形成。但是这种现象出现的很晚，时间也很短暂。凋亡的特征是内源性核酸内切酶被激活，细胞自身的染色质或DNA被切割，出现单链或双链缺口，并产生与DNA断点数目相同的3’-OH末端。末端脱氧核糖核酸转移酶（Terminal deoxynucleotidyl Transferase ）可以将DGX标记的dUTP （DIG-dUTP）标记至3’-OH末端，DIG-dUTP结合在DNA断点部位，可以通过生物标记的抗DGX抗体（Anti-DIG-Biotin）反应后，再结合荧光素FITC或者过氧化物酶POD标记的链酶亲和素（SABC-FITC/SABC-POD）。FITC在490-495nm激化，在520-530nm发射荧光，在荧光显微镜下呈明亮黄绿色。POD的在加入显色底物DAB显示后，凋亡的细胞核呈棕黄色。用户根据实验需要，在不同切片上用两套不同显示系统观察。
工作原理：在机体内部随时都在发生着细胞的死亡。传统上用显微镜来观察细胞的死亡，其特征为核染色质的浓缩及碎片的形成。但是这种现象出现的很晚，时间也很短暂。凋亡的特征是内源性核酸内切酶被激活，细胞自身的染色质或DNA被切割，出现单链或双链缺口，并产生与DNA断点数目相同的3’-OH末端。末端脱氧核糖核酸转移酶（Terminal deoxynucleotidyl Transferase ）可以将DGX标记的dUTP （DIG-dUTP）标记至3’-OH末端，DIG-dUTP结合在DNA断点部位，可以通过生物标记的抗DGX抗体（Anti-DIG-Biotin）反应后，再结合荧光素FITC或者过氧化物酶POD标记的链酶亲和素（SABC-FITC/SABC-POD）。FITC在490-495nm激化，在520-530nm发射荧光，在荧光显微镜下呈明亮黄绿色。POD的在加入显色底物DAB显示后，凋亡的细胞核呈棕黄色。用户根据实验需要，在不同切片上用两套不同显示系统观察。
试剂盒内容：
1. 标记缓冲液(Labeling Buffer) 1ml
2. 末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT,×20) 20μι
3. DIG-dUTP (×20) 20μι
4. 封闭液(Blocking Reagent) 4ml
5. 生物素化抗DGX抗体(× 100) 20μι
6. SABC-FITC (× 100) 20μι
2. 末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT,×20) 20μι
3. DIG-dUTP (×20) 20μι
4. 封闭液(Blocking Reagent) 4ml
5. 生物素化抗DGX抗体(× 100) 20μι
6. SABC-FITC (× 100) 20μι
7. SABC-POD (× 100) 20μι
8. Proteinase K (×200) 50μι
9. 抗体稀释液 4ml
10.未染色阳性对照片2 张
8. Proteinase K (×200) 50μι
9. 抗体稀释液 4ml
10.未染色阳性对照片2 张
用户自备试剂：
1. 多聚赖氨酸或APES(博士德公司有售)。
2. 0.01M TBS,PH7.5(配法:1L 双蒸馏水中加入8.5 克氯化钠,1.2 克Tris 和0.45—0.5ml 纯乙酸。)
3. 水溶性封片剂。
2. 0.01M TBS,PH7.5(配法:1L 双蒸馏水中加入8.5 克氯化钠,1.2 克Tris 和0.45—0.5ml 纯乙酸。)
3. 水溶性封片剂。
操作步骤：
1. 样品处理
(1) 玻片预先用多聚赖氨酸或APES 进行处理。
(2) 细胞涂片和冰冻切片：最重要的是及时固定。用4%多聚甲醛/0.01M PBS(pH7.0---7.6)室温下固定30—60 分钟。0.01M PBS 洗2 分钟×2 次。蒸馏水洗涤2 分钟×2 次。
(3) 组织：有条件时应及时固定。常规4%多聚甲醛/0.01M PBS(pH7.0---7.6)或10%中性缓冲福尔马林固定4 小时以上，石蜡包埋。切片常规脱蜡入水（脱蜡务必干净）。
1. 样品处理
(1) 玻片预先用多聚赖氨酸或APES 进行处理。
(2) 细胞涂片和冰冻切片：最重要的是及时固定。用4%多聚甲醛/0.01M PBS(pH7.0---7.6)室温下固定30—60 分钟。0.01M PBS 洗2 分钟×2 次。蒸馏水洗涤2 分钟×2 次。
(3) 组织：有条件时应及时固定。常规4%多聚甲醛/0.01M PBS(pH7.0---7.6)或10%中性缓冲福尔马林固定4 小时以上，石蜡包埋。切片常规脱蜡入水（脱蜡务必干净）。
2. 标本片加0.01M TBS 1:200 新鲜稀释Proteinase K 37℃消化1—15 分钟,0.01M TBS 洗2 分钟×3次。(细胞涂片和冰冻切片一般不消化或消化10—60 秒钟。新鲜石蜡切片消化5-10 分钟。陈旧石蜡切片消化10-15 分钟)。
3. 标本片加标记缓冲液(Labeling Buffer) 20μι/片,以保持切片湿润。按每张切片取TdT和DIG-d-UTP 各1μι，加入18μι标记缓冲液中，混匀。甩去切片上多余液体后加标记液，20μι/片。置样品于湿盒中，37℃标记2 小时。
4. 0.01M TBS 洗2 分钟×3 次。
5. 加封闭液50μι/片，室温30 分钟，甩掉封闭液，不洗。
6. 用抗体稀释液1：100稀释生物素化抗DGX抗体：（取1ml 抗体稀释液加生物素化抗DGX抗体10μι），混匀后50μι/片加至标本片上。置样品于湿盒中，37℃反应30 分钟。0.01M TBS洗2 分钟×3 次。
7. 用抗体稀释液1：100稀释 SABC-FITC/（SABC-POD）：取1ml 抗体稀释液加 SABC-FITC/（SABC-POD）10μι，混匀后50μι/片加至切片。37℃反应30 分钟。0.01M TBS 洗5 分钟×4 次。
3. 标本片加标记缓冲液(Labeling Buffer) 20μι/片,以保持切片湿润。按每张切片取TdT和DIG-d-UTP 各1μι，加入18μι标记缓冲液中，混匀。甩去切片上多余液体后加标记液，20μι/片。置样品于湿盒中，37℃标记2 小时。
4. 0.01M TBS 洗2 分钟×3 次。
5. 加封闭液50μι/片，室温30 分钟，甩掉封闭液，不洗。
6. 用抗体稀释液1：100稀释生物素化抗DGX抗体：（取1ml 抗体稀释液加生物素化抗DGX抗体10μι），混匀后50μι/片加至标本片上。置样品于湿盒中，37℃反应30 分钟。0.01M TBS洗2 分钟×3 次。
7. 用抗体稀释液1：100稀释 SABC-FITC/（SABC-POD）：取1ml 抗体稀释液加 SABC-FITC/（SABC-POD）10μι，混匀后50μι/片加至切片。37℃反应30 分钟。0.01M TBS 洗5 分钟×4 次。
8.加SABC-FITC的在荧光显微镜下用蓝色光激发观察。
9.加SABC-POD的，可选用DAB 显色：取1ml 蒸馏水，分别加入DAB 试剂盒中A，B，C 试剂各一滴，混匀后加至标本片上，显色10-30 分钟左右。水洗。
9.加SABC-POD的，可选用DAB 显色：取1ml 蒸馏水，分别加入DAB 试剂盒中A，B，C 试剂各一滴，混匀后加至标本片上，显色10-30 分钟左右。水洗。
10. 苏木素轻度复染。0.01M TBS 洗，蒸馏水洗。水溶性封片剂封片。
结果判定：
荧光显微镜下：细胞核中有黄绿色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞。
普通显微镜下：细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞。
注意事项：
1.试剂盒严格-20℃存放。
2.初用时如试管底部无可见的试剂，在离心机离心5 分钟，使试剂沉至管底。
3.检测过程中切勿使样品干涸。
结果判定：
荧光显微镜下：细胞核中有黄绿色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞。
普通显微镜下：细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞。
注意事项：
1.试剂盒严格-20℃存放。
2.初用时如试管底部无可见的试剂，在离心机离心5 分钟，使试剂沉至管底。
3.检测过程中切勿使样品干涸。
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