牛血纤维蛋白原用于纳豆激酶测定价格

英文名：Fibrinogen，Fg

库存：大量

供应商：恒斐生物

CAS号：9001-32-5 高纯 90%

规格：100mg

纤维蛋白原在纳豆激酶活性测定中的应用

人体内的血栓常引发脉管栓塞、脑血栓中风、急性心肌梗塞等严重的心血管疾病，尤其对中老年人的身体健康造成很大的危害，全世界有血栓患者1500万人，潜在的溶栓剂市场有20亿美元。但当前的溶栓剂，如尿激酶(SK)和链激酶(UK)作为第一代溶栓剂，缺乏纤维蛋白选择性，副作用大；如第二代溶栓剂重组组织型纤溶酶原激活剂，存在价格高等缺点，因此它们难以成为适用的大众药品。而纳豆激酶具有溶栓能力强、无任何毒副作用、成本低、可由细菌发酵生产等优点，具有极为诱人的市场前景。近年来，对纳豆激酶的研究和开发越来越受到众多科研工作者的重视，取得了许多新进展。

一、纳豆激酶简介

纳豆激酶(Nattokinase，NK)是日本学者须见洋行于1987年发现的来源于纳豆的溶栓酶[1]。其激活纤溶酶原后产生纤溶酶，亦有文献报道具有直接的纤溶活性[2、3]。NK为无臭无味的白色粉末，溶于水，是由275个氨基酸残基组成的蛋白质，呈单链结构、无二硫键，相对分子质量为27728。纯化的NK作SDS-PAGE，于相对分子质量28000处有明显谱带；等电点为pI(8.6±0.3)。该酶作为丝氨酸蛋白酶，其活性中心为L天冬氨酸、组氨酸和丝氨酸。NK在pH4.0～12.0范围内稳定，pH3以下仍有活性。该酶通过胃后在肠道的碱性环境下，更有利于酶的稳定，从而能保持一定的活性。

纳豆激酶是一种优良的抗栓制剂，表现出血浆纤维蛋白溶酶的特异性，同其他溶血栓药物相比，纳豆激酶有以下几个优点[4]：

a.由食品纳豆中提取，安全性好；

b.相对分子质量小，易被人体吸收；

c.可以由消化道吸收，因此可以成为口服性溶血栓药物；

d.直接作用于纤维蛋白，因而作用迅速；

e.可利用细菌发酵生产，因而造价低廉。

二、活性测定方法

纳豆激酶的活性测定方法一般采用其间接或直接的纤维蛋白溶解作用。

纤维蛋白原（Fibrinogen，Fg），分子量约340KD，由α、β、γ三对不同多肽链所组成，多肽链间以二硫键相连。在凝血酶作用下，α链与β链分别释放出A肽与B肽，生成纤维蛋白单体。在此过程中，由于释放了酸性多肽，负电性降低，单体易于聚合成纤维蛋白多聚体。但此时单体之间借氢键与疏水键相连，尚可溶于稀酸和尿素溶液中。进一步在Ca2+与活化的ⅩⅢ因子作用下，单体之间以共价键相连，则变成稳定的不溶性纤维蛋白凝块。

纳豆激酶活性测定方法作为研究的基础，也不断地建立并得到改进。现已有的活性测定方法包括以下几种。

1、纤维蛋白原琼脂平板法[5]

1. 1 纤维蛋白原琼脂平板的制作称取2g琼脂糖置于250ml烧瓶中，加入0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5)180ml，沸水浴中加热30min，冷却至55～60℃，加入事先配好的纤维蛋白原溶液20ml(含100～150mg)，迅速混匀，事先在每个培养皿中加入200μl凝血酶(50U/ml)和200μl纤溶酶原，然后再在每个培养皿中加入20ml纤维蛋白原琼脂糖溶液，迅速混匀后，静置10min，凝固后即为半透明的平板。用3mm套管打孔，每个平板打孔4～6个。

1.2 标准曲线的制作在平板上选定6个孔，每孔内加入0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5)10μl。将稀释好的标准品尿激酶(5IU/ml)依次加入6个孔中，体积分别为2μl、4μl、6μl、8μl、10μl、12μl混匀后，置37℃恒温箱中，保温18h。用卡尺测量每个溶圈的直径，以溶圈面积为纵坐标，以标准品尿激酶每毫升活性位为横坐标作图。

1.3 样品的测定在平板上选定3个孔，每个孔加入0.01mol/LpH7.5磷酸盐缓冲液10μl然后将稀释好的样品编号，依次加入孔内2μl、6μl、10μl。置37℃恒温箱中保温18h。用卡尺量取溶圈的直径，计算溶圈面积，由标准曲线计算其活力。3点取平均值，样品活力以“尿激酶活力单位”(UK)表示。为了减少系统误差，将样品与标准品置于同一平板上进行测定。

纳豆激酶活性测定结果照片[3]。

2、气泡法（CLT）[6]

取试管4支，各加纤维蛋白原溶液(6.67mg/ml巴bi妥氯化钠缓冲液)置37℃水浴中。向4支试管中分别加入ba比妥氯化钠缓冲液0.6、0.7、0.8、0.9mL，保温5min。在相应试管中分别加入0.4、0.3、0.2、0.1ml 60U/mL尿激酶标准溶液，然后每隔1min各加入0.4mL混合液(牛凝血酶6.0U/ml∶牛纤维蛋白溶酶原酪蛋白单位/ml=1∶1，临用前配)，立即摇匀，并在凝聚瞬间振摇使凝块底部产生气泡，置37℃水浴中用秒表计时，试管中凝块内小气泡上升到反应系统体积一半时，作为反应终点，立即计时。以尿激酶单位为纵坐标，终点时间为横坐标，在对数坐标纸上绘制标准曲线。待测样品按上述方法操作，在标准曲线上查知酶活。

气泡法测定酶活性的原理为：纤维蛋白原在凝血酶作用下形成纤维蛋白，试管中溶液凝聚为胶状；纤维蛋白溶酶原在激酶激活下溶解纤维蛋白，胶体底部溶解并产生气泡向上移动，根据气泡移动的时间来确定激酶的溶纤活性。当用气泡法测定纳豆激酶活性时出现异常现象，纤维蛋白原没有形成纤维蛋白，也就是试管中无凝聚现象产生。为了探其原因，对气泡法测定酶活方法进行如下改进。

测定方法改进后，气泡法测定纳豆激酶活性得以进行。进一步试验发现，若试验中不加纤维蛋白溶酶原，则纳豆激酶活力减少一半。分析其原因在于：尿激酶主要通过激活纤维蛋白溶酶原而起溶纤作用，而纳豆激酶除了具有激活作用外，还可直接作用于纤维蛋白原，使其难以形成纤维蛋白，也就是抗凝作用。原测定方法中纳豆激酶先加入到纤维蛋白原溶液中，可能对纤维蛋白原起作用，待凝血酶和纤维蛋白溶酶原混合液加入后，因底物缺陷而不能形成纤维蛋白而凝结，这就是纳豆激酶的抗凝作用。

3、试管法[7]

于直径15mm的硅化试管中依次加入pH7.7的咪唑缓冲液、NK收集液、凝血酶和纤维蛋白原，立即振摇数秒，使之产生絮状物，置38℃水浴温育30min，随即置于冰浴中以终止反应。用100目尼龙网过滤试管中未溶解的纤维蛋白，滤纸吸干，用蒸馏水漂洗，再用滤纸吸干，于小试管中加3ml0.2mol LNaOH溶液，在沸水中煮沸15min后冷却。用分光光度计测定溶液在280nm处的吸收值，应用活力计算公式，计算纤溶活力。