T4 Polynucleotide Kinase (T4 PNK)

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Features

• 在Fermentas公司的限制酶和RT缓冲液中均有活性。

Applications

• 核酸5’-末端标记(3, 4)，见图1和操作方法。标记产物用于：
  一 杂交探针，
  一 转录图谱探针，
  一 凝胶电泳分子量标准，
  一 DNA测序引物，
  一 PCR引物。
• 连接反应前5’-磷酸化修饰寡核苷酸接头、PCR扩增产物、其它DNA或RNA分子。
• [³²P] 后标记分析方法检测DNA修饰(5, 6)。
• 切除3’-磷酸基团(2)。
• PCR引物磷酸化。

说明

T4 Polynucleotide Kinase (T4多聚核苷酸激酶，T4 PNK)是一种多聚核苷酸5’-羟基激酶，催化ATP的γ-磷酸基团转移到单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸、3’-单磷酸核苷的5’-OH(正向反应)。该反应是可逆的。当ADP存在时，T4 Polynucleotide Kinase具有5’-磷酸酶活性，催化5’-P-寡聚-/多聚核苷酸和ATP末端5’ -磷酸基团的交换(置换反应)(1)。

该酶也是一种3’-磷酸酶(2)。

来源

大肠杆菌菌株，含有T4噬菌体来源克隆基因pseT。

分子量

该酶是一个二聚体，由两个28.9�kDa的亚基组成。

活性单位定义

1个活性单位是指37°C、30分钟内将1nmol ATP分子中的γ-磷酸基团转移到5’-OH DNA所需的酶量。

酶活性分析混合物：100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 0.5 mM 5'-OH DNA, 0.05 mM ATP, 0.1 MBq/ml [gamma-³³P]-ATP.

保存缓冲液

保存缓冲液组分：
20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 25 mM KCl, 0.1 mM�DTA, 2 mM DTT和50% (v/v)甘油。

10X 反应缓冲液A(正向反应)

500 mM Tris-HCl (pH 7.6, 25°C), 100 mM MgCl₂, 50 mM DTT, 1 mM亚精胺。

10X 反应缓冲液B(置换反应)

500 mM imidazole-HCl (pH 6.4, 25°C), 180 mM MgCl₂, 50 mM DTT, 1 mM亚精胺, 1 mM ADP。

24% PEG溶液

24% (w/v) 聚乙二醇6000。

质量控制

相关测试表明无内切或外切脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶污染。功能测试为DNA 5’ -末端标记。

抑制与失活

• 抑制剂：金属螯合剂、KCl和NaCl(浓度超过50�mM时)、磷酸盐、铵离子。
• 失活：75°C加热10分钟或加入EDTA。

备注

• 聚乙二醇(PEG)和亚精胺都会增加磷酸化反应速度和效率(7)。PEG用于置换反应混和物，见操作说明书。
• 铵离子会抑制T4 Polynucleotide Kinase活性，因此磷酸化之前用醋酸钠沉淀DNA (1, 2)。

图1。不同类型5’-末端的DNA标记效率。