保存条件 ：-20 ºC

保质期 ：有效期1年

英文名 ：Hieff Clone Plus One Step Cloning Kit

库存 ：大量

供应商 ：翌圣生物科技(上海)股份有限公司

CAS号 ：点击查看

规格 ：20T

Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit是一款简便、快速、高效的DNA定向克隆产品，该试剂盒可以将PCR产物定向克隆至任何载体的任何位点，可高效克隆50 bp-10 kb片段。将载体线性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的线性化载体末端同源序列，使得插入片段PCR产物5’和3’末端分别带有与线性化载体两末端对应的完全一致的序列。PCR产物和线性化载体在重组酶的作用下，仅需50℃反应20 min即可进行转化，完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。

实验流程

图1 Hieff Clone^® 一步法快速克隆试剂盒实验流程图。

 

简版操作步骤

一、重组反应
1. 线性化载体与插入片段使用量计算
Hieff Clone^® 重组反应体系最适载体使用量为0.03 pmol；最适载体与插入片段摩尔比为1:2-1:3，即最适插入片段使用量为0.06-0.09 pmol。这些摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：
最适载体使用量 = [0.02×载体碱基对数]ng (0.03 pmol)
最适插入片段使用量 = [0.04×插入片段碱基对数]ng (0.06 pmol) 或= [0.06×插入片段碱基对数]ng (0.09 pmol)
例如，将长度为2 kb的插入片段克隆至长度为5 kb的载体时，载体的最适使用量应为：0.02 × 5000 = 100 ng；插入片段最适使用量应为：0.04 × 2000 = 80 ng或0.06 × 2000=120 ng。
【注】：

1. 当插入片段长度大于载体时，最适载体与插入片段使用量的计算方式应互换，即插入片段当做载体，载体当做插入片段进行计算。
2. 线性化载体的使用量应在50-200 ng之间；插入片段扩增产物的使用量应在20-200 ng之间。当使用上述公式计算最适使用量超出这个范围时，则选择最低或最高使用量即可。

1. 线性化载体和插入片段扩增产物未纯化，直接使用时，使用总体积应不超过反应体系体积的1/5，如20 μL体系不超过4 μL。

2.重组反应体系（推荐冰上配制，各组分使用前需混匀）

组分	重组反应	阴性对照-1	阴性对照-2	阳性对照
ddH2O	Up to 20 μL	Up to 20 μL	Up to 20 μL	Up to 20 μL
2×Hieff Clone® Enzyme Premix	10 μL	0 μL	0 μL	10 μL
线性化载体	X μL	X μL	0 μL	1 μL
插入片段	Y μL	0 μL	Y μL	1 μL

3.重组反应条件
1）体系配制完成后，用移液器轻轻吸打混匀各组分，短暂离心将反应液收集至管底。
2）置于50℃反应20 min。当插入片段＞5 kb时，可将孵育温度延长至25 min。
【注】：建议在PCR仪或水浴锅等温控精确的仪器上进行反应。
3）待反应完成后，建议将反应管置于冰上冷却5 min，以防温度过高降低感受态转化效率。
4）反应产物可直接进行转化，也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。
二、 重组产物转化、涂板
1）在冰上解冻克隆感受态细胞（如：DH5α Chemically Competent Cell，Cat#11802）。
2）取10 μL冷却重组产物，加入到100 μL感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置25 min。
3）42℃热激45 sec，冰浴孵育1-2 min。
4）加入750 μL SOC或LB培养基，37℃孵育2 min充分复苏。37℃，200 rpm，摇菌60 min。
5）5000 rpm离心1 min，弃掉750 μL上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀。待菌液被吸收，将平板倒置，于37℃过夜培养。

三、克隆鉴定

最方便快捷的方法是菌落PCR。用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至20-50 μL LB培养基中混匀，直接取1 μL作为PCR模板。推荐至少用一条通用测序引物进行菌落PCR，这样可以避免PCR假阳性的产生。后续也可做酶切或测序鉴定。

应用实例

图2：Hieff Clone^® Plus One Step Cloning Kit可以有效克隆不同长度的单片段基因。A-D：重组转化平板。E：插入片段和载体浓度检测电泳图。F-H：插入片段PCR鉴定电泳图。箭头指示目的条带。载体：pFastBac1，4.7 kb，插入片段大小分别是1.2 kb，3 kb和5 kb，载体与插入片段摩尔比：1:3，重组反应条件：50℃，20 min。

 

常见问答

1、最佳克隆位点选择？
答：在选择克隆位点时，应避免选择克隆位点上下游50 bp内有重复序列的区域。当克隆位点上下游25 bp区域内GC含量均在40%-60%范围内时，重组效率将达到最大。若高于70%或者低于30%，重组效率会受到较大影响。
2、无克隆长出或克隆数较少？
答：出现该情况，建议使用阳性对照，可排除试剂盒本身的影响，并进行进一步判定，主要有以下可能情况：
1）引物设计不合适：推荐【同源序列（15-25 bp）+完整的酶切位点+基因特异性扩增引物】，GC含量40% - 60%。
2）感受态细胞效率低：使用新鲜制备或妥善冻存的感受态细胞，确保其转化效率>10⁷ cfu/μg。每次操作时可设置一组转化质粒的对照实验，以检测感受态细胞的转化效率。连接产物体积不应超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率。
3）线性化载体和插入片段扩增产物的使用量不足/过量，或者比例不佳：尽量按照推荐的量和比例配制重组反应体系。
4）线性化载体和插入片段扩增产物不纯，抑制反应：线性化载体和插入片段扩增产物未纯化，直接使用时，使用总体积应不超过反应体系体积的1/5，如20 μL体系不超过4 μL。建议线性化载体、插入片段扩增产物进行凝胶回收纯化，纯化产物溶解在ddH₂O中。
3、出现较多假阳性
答：主要有以下可能情况：
1）载体线性化不完全：即使是痕量未完全酶切的载体也会产生很高的转化背景。可通过阴性对照检测载体是否线性化完全，优化酶切体系，提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物等都可以有效减少环状质粒残留。
2）插入片段扩增产物混有非特异扩增产物：建议：①优化PCR体系，提高特异性；②胶回收PCR产物；③鉴定更多克隆。
3）反应体系中混入了相同抗性的质粒：PCR扩增模板(载体或插入片段)为环状质粒时，若扩增产物直接用于重组反应，残留环状质粒模板会产生较高的转化背景。建议使用预线性化质粒作为扩增模板、扩增产物进行DpnI消化或扩增产物进行胶回收纯化。
4、菌落PCR无条带
答：主要有以下可能情况：
1）引物不正确：推荐使用载体的通用引物或至少使用一条通用引物进行菌落PCR检测。
2）PCR体系或程序不合适：没有目的条带也没有空质粒条带，建议优化PCR体系、程序；或者提取质粒，以质粒做模板PCR验证；或者进行酶切验证。
3）重组失败：没有目的条带，只有空质粒的条带，说明重组不成功，载体线性化不完全，建议优化酶切体系。
HB230128