服务名称：专业的病毒包装技术服务

慢病毒包装

产品简介
慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷1型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。具有感染谱广泛、可以有效感染分裂期和静止期细胞、长期稳定表达外源基因等优点，因此成为导入外源基因的有力工具。现在慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA干扰、microRNA研究以及活体动物实验中。

汉恒服务项目
汉恒生物科技（上海）有限公司提供慢病毒载体构建、RNAi(shRNA)、miRNA、过表达和干扰慢病毒包装以及基于慢病毒技术的稳定细胞系构建服务。

整体实验流程
（一）实验流程（1、2、3为并列步骤）
1. 慢病毒过表达质粒载体的构建设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，采用PCR技术(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（cDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。
2. 慢病毒干扰质粒载体的构建合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体。
3. miRNA载体构建从 Genomic 中调取基因相应的Mir 前体, 并在调取引物中引入酶切位点。
4. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒（两质粒包装系统），三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。
（二）流程图

提供产品

慢病毒感染实例

腺病毒包装

重组腺病毒（AdV）是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。目前常用的腺病毒载体基于人腺病毒5型（Ad5），其基因组是36 kb长的线性双链DNA。腺病毒可通过自身的纤维（fiber）和细胞表面的受体结合被内吞进入细胞，然后从内吞体（endosome）转移到细胞质和细胞核内，借助细胞的转录和翻译机器启动病毒的复制组装。一个完整的病毒生活周期会引发细胞死亡从而释放出病毒粒子。

腺病毒优点：
感染范围广，几乎可以感染所有的分裂和不分裂细胞系、原代细胞和部分组织；
感染效率高达 100%，可全面超越其他病毒载体工具和脂质体转染；
对外源基因容载能力大（可以高达 8 Kb）；
不整合基因组；
滴度高，操作方便。
因此，重组腺病毒是一种最具有潜力的基因递送工具。

悬浮细胞专用腺病毒感染实例
病毒：悬浮细胞专用腺病毒Ads-GFP，1×10¹⁰PFU/ml
感染细胞：Jurkat、K562、HL-60、L2110
感染方式：MOI=500
检测方法：感染72H后荧光显微镜检测

原代T细胞专用腺病毒感染实例

腺相关病毒

AAV产品简介

腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector，AAV）属于微小病毒科( parvovirus)，为无包膜的单链线状 DNA 病毒。AAV 的基因组约 4700bp，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由 145 个核苷酸组成的 2 个反向末端重复序列(ITR)之间。由于腺相关病毒具有宿主范围广、安全性高、免疫原性低、表达稳定和物理性质稳定等优点，已被广泛地应用于基础研究和临床试验中，并且腺相关病毒载体已成为世界上最常用的基因治疗载体之一。

图 1. AAV 基因组结构

AAV病毒特点

1. 安全性高：迄今从未发现野生型 AAV 对人体致病，重组 AAV 基因组序列上去除了大部分的野生型 AAV 基因组元件，进一步保证了安全性；
2. 免疫原性低：AAV2 的基因组仅 4681 个核苷酸，便于用常规的重组 DNA技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；
3. 宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；
4. 表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；
5. 物理性质稳定：在 60℃不能被灭活，能抗氯仿；

AAV生物学特性

表1 不同病毒的生物学特性比较

AAV载体不同血清型

研究发现 AAV 具有多种血清型，各种不同血清型的 AAV 载体的主要区别是衣壳蛋白不同，因此对不同的组织和细胞的转染效率存在差异。目前汉恒生物在包装腺相关病毒时有 12种不同的 AAV 血清型可供客户选择，建议客户针对不同组织器官选择相应血清型的 AAV 病毒，见表 2。

表2. 12种不同血清型AAV对各组织器官细胞的亲和性

服务流程

AAV应用介绍

A. AAV9感染小鼠脑组织（PMID: 23503602）
B. AAV2感染大鼠脑组织
C. AAV2感染肾脏（PMID: 23216315）
D. AAV感染心脏（PMID: 20703310）
E. AAV9感染骨骼肌（PMID: 21811247）
F. AAV感染肝脏（PMID: 19861950）