1、技术简介

磷酸化是生物体内存在最为广泛的一种蛋白质翻译后修饰，可以发生在约1/3以上的蛋白质中，对各种细胞过程和生命活动如信号转导和细胞周期等起着重要的调节作用。蛋白质磷酸化参与调节细胞多种生命活动过程，包括细胞的增殖、发育和分化、细胞骨架调控、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩、新陈代谢等。因此，分析蛋白质磷酸化修饰在不同生理病理状态下的相对量的变化，可进一步发掘与疾病发生发展相关的重要生物标志物，为揭示其分子机理奠定基础。近年来，随着以液相色谱-质谱连用技术为核心的“鸟枪法（shotgun）”蛋白质组学的快速发展，磷酸化肽段/蛋白质富集及预分级技术的进步，磷酸化肽段质谱裂解方式，高速扫描高质量精度质谱以及磷酸化肽段定性定量相关软件的巨大发展，均为大规模，高通量的磷酸化蛋白质组学分析奠定了基础。目前，对蛋白质组磷酸化进行规模化全面分析已经成为现实，在保证试验结果的可靠性和准确性的同时，在一次试验中即可对成千上万个磷酸化位点同时进行分析表征。

2、技术原理

同位素标记磷酸化蛋白质组学（Phosphoproteomics）技术通过巧妙的将iTRAQ标记试剂与磷酸化肽段高效富集相互结合来达到对磷酸化肽段（蛋白质）同时进行定性和定量的目的。在本实验中，经过蛋白质提取（Protein Extract）获得组织细胞中的全蛋白，全蛋白在胰酶作用下被酶解（Trypsin Digestion）成肽段，iTRAQ试剂对所获得的全部肽段进行标记（iTRAQ定量原理见服务2中技术原理部分）。标记混合之后的肽段经过富集得到磷酸化肽段。
目前，固相金属离子亲和层析法（IMAC），强阳离子交换色谱法（SCX），金属氧化物亲和色谱法以及抗体法是几种常用的磷酸化肽段分离和富集方法。本实验将选用操作简单，富集效率高的二氧化钛（TiO2）进行磷酸化肽段的富集。TiO2富集法是目前最为成熟的金属氧化物富集法。TiO2在不同的pH值下，可以表现为路易斯酸或路易斯碱。在酸性条件下，钛原子带正电表现为路易斯酸，可以与阴离子结合；在碱性条件下，则表现为路易斯碱，可以与阳离子结合。这样磷酸化肽段的磷酸基在酸性条件下与之结合，碱性条件下洗脱达到富集磷酸化肽段的目的。