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英文名 :从稳定于PAXgene Blood RNA Tubes的全血中分离和纯化胞间RNA
库存 :现货供应
规格 :kit
从稳定于PAXgene Blood RNA Tubes的全血中分离和纯化胞间RNA
- 符合欧洲体外诊断98/79/EC指令
- 与采样、稳定及纯化形成整合的系统
- 在18–25°C条件下可稳定多至3天
- 在–20°C或–70°C条件下至少稳定60个月
- 分析前标准化的样本处理过程
PAXgene Blood RNA系统包括用于血液采集、稳定和运输的PAXgene Blood RNA Tubes(由BD提供,货号762165),以及基于硅胶膜技术、离心柱法分离纯化的PAXgene Blood RNA Kit。纯化可使用离心机进行手工操作,也可在QIAcube全自动核酸纯化仪上自动运行。该产品表现卓越,确保高度可靠的RNA纯化。
PAXgene Blood RNA Tubes适用于采集全血并稳定细胞内RNA,在18–25°C条件下可稳定长达3天(参见RNA stability at 18–25°C: FOS和RNA stability at 18–25°C: IL1B),或在2–8°C条件下稳定长达5天(参见RNA stability at 2–8°C: FOS和RNA stability at 2–8°C: IL1B)。当前的数据显示,细胞内RNA在–20°C或–70°C条件下可保存至少60个月。
使用PAXgene Blood RNA System纯化的总RNA纯度高,A260/A280 值在1.8和2.2之间,且基因组DNA含量不超过1.0% (w/w)。当使用30%的洗脱液时,至少95%的样品在RT-PCR中没有出现反应抑制的情况。
样品制备的平均时间为90分钟(根据12个样品的制备时间),手工操作只需40分钟。在处理95%以上样品时,2.5 ml健康人类全血的RNA产量不低于3 µg。由于产量高度依赖于供体,单次产量可能会有变动。对于单个供体,PAXgene Blood RNA System 确保产量可重复性高(参见Reproducible and repeatable RNA purification和Repeatability and reproducibility of RNA yield)以及RT-PCR的可重复性高(参见Reproducibility between users、Reproducibility between kit lots, 和表格),高度适合于临床诊断检测。
对于超过95%的样本,从2.5 ml健康人类全血中获得的RNA产量不少于3 μg。图片RNA yield and purity — automated processing显示的是3名实验员使用3批试剂盒自动化处理288个样本的RNA产量。由于使用的是混合血液样本而非单个的PAXgene Blood RNA Tubes,实验结果不能反映单一个体血液样本的RNA预期产量。由于产量高度依赖于供体,单个产量会有差别。
当使用多至30%的洗脱液时,至少95%的样品不会出现RT-PCR抑制。通过对RNA阴性样品(水)中beta-球蛋白和FOS转录子序列与RNA阳性样本(人类全血)进行定量RT-PCR分析,未发现使用自动化流程处理样品中有交叉污染。
使用PAXgene Blood RNA System的自动流程制备的RNA纯度高,没有RT-PCR抑制(见上文),A260/A280值在1.8 和2.2之间。经real-time PCR分析beta-肌动蛋白的序列发现,超过95%的样品的基因组DNA含量不高于1% (w/w) 。图片RNA yield and purity — automated processing显示了3个实验员使用3批试剂盒处理288个样品的A260/A280值和相对基因组DNA含量。
如图Reproducibility between automated and manual protocols所示,使用PAXgene Blood RNA System自动纯化RNA的流程提供高度可重复的RT-PCR结果,适用于临床诊断检测。
T
检测系统 | FOS/18S rRNA assay | IL1B/18S rRNA assay | ||
---|---|---|---|---|
数据对比 | 平均值 | ± SD | 平均值 | ± SD |
(ΔΔCT) | (ΔΔCT) | (ΔΔCT) | (ΔΔCT) | |
同一使用者使用不同批试剂盒的可重复性 | ||||
所有使用者,第一批–第一批 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
所有使用者,第一批–第二批 | –0.03 | 0.48 | –0.07 | 0.66 |
所有使用者,第一批–第三批 | –0.21 | 0.52 | 0.11 | 0.71 |
不同使用者使用同一批试剂盒的可重复性 | ||||
所有批次,使用者A–使用者A | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
所有批次,使用者A–使用者B | –0.46 | 0.44 | –0.06 | 0.69 |
所有批次,使用者A–使用者C | –0.31 | 0.60 | –0.15 | 0.71 |
PAXgene Blood RNA Kit用于从在PAXgene Blood RNA Tube中采集的2.5 ml人类全血中纯化总RNA,操作简单,可手工操作,也可自动化运行(参见Manual PAXgene Blood RNA procedure和Automated PAXgene Blood RNA procedure)。
PAXgene Blood RNA Tubes 含有专利申请中的特定试剂,基于RNA固定的专利技术(US Patents 6,602,718 和6,617,170)。这些试剂成分可保护RNA分子,避免其被RNA酶降解,并将基因表达体内变化的改变降至最小。PAXgene Blood RNA Tubes适用于采集全血并稳定细胞内RNA,在18–25°C条件下可稳定长达3天(参见RNA stability at 18–25°C: FOS和RNA stability at 18–25°C: IL1B),或在2–8°C条件下稳定长达5天(参见RNA stability at 2–8°C: FOS和RNA stability at 2–8°C: IL1B)。当前的数据显示,细胞内RNA在–20°C或–70°C条件下可保存至少60个月。
PAXgene Blood RNA纯化操作流程简单,可手动或自动进行(参见Manual PAXgene Blood RNA procedure和Automated PAXgene Blood RNA procedure)。
PAXgene Blood RNA纯化手动流程
将重悬的沉淀和蛋白酶K一起溶解在经优化的缓冲液中孵育,进行蛋白质酵解。然后应用PAXgene Shredder离心柱再次离心,匀浆细胞裂解液,并去除剩余的细胞残骸。将流过部分的上清液转移到干净的微型离心管中,加入乙醇调节结合条件,将裂解液装入一个PAXgene RNA离心柱中。快速离心后,RNA会选择性地结合到PAXgene硅胶膜上,杂质则流过。剩余的杂质通过几次高效洗涤去除。在第一次和第二次洗涤步骤之间,使用DNA酶处理膜,以去除微量残余的DNA。洗涤之后,使用洗脱缓冲液洗脱RNA并进行热变性。
PAXgene Blood RNA纯化自动流程
使用QIAcube全自动核酸纯化仪制备样品的流程与手动法相同,您可继续使用PAXgene Blood RNA Kit纯化高品质RNA。
自动化的RNA纯化流程由两个部分组成,"PAXgene Blood RNA Part A"和"PAXgene Blood RNA Part B",在两个部分之间需要短暂的手工操作。
将经离心、洗涤、重悬的核酸沉淀从PAXgene Blood RNA Tube转移到离心管中,将离心放到QIAcube全自动核酸纯化仪工作台的恒温震荡器中。实验员选择并启动菜单中的"PAXgene Blood RNA Part A"。QIAcube全自动核酸纯化仪会自动运行,直到将RNA洗脱至洗脱缓冲液中。实验员将含有已纯化RNA的离心管转移到QIAcube全自动核酸纯化仪的恒温震荡器中,选择并启动菜单中的"PAXgene Blood RNA Part B",QIAcube全自动核酸纯化仪会执行热变性。
样本平均制备时间是125分钟(基于制备12个样本的时间),手工操作时间只需约20分钟。
该试剂盒与PAXgene Blood RNA Tubes共同使用,可从全血中分离纯化细胞内RNA进行RT‑PCR。
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