DC-CIK细胞处理试剂盒

【用途】本试剂盒专门用于对单个核细胞进行体外诱导处理，获得DC-CIK细胞。该单个核细胞可从人类的骨髓、脐带血或外周血获得。

【DC-CIK细胞培养原理】
DC-CIK细胞治疗恶性肿瘤是目前肿瘤生物治疗最成熟的治疗方案之一，DC(树突细胞)能够准确识别肿瘤抗原并将信息传递给人体免疫系统，当负载有肿瘤抗原信息的DC细胞输入人体后，将肿瘤信息传递给抗肿瘤细胞，使其具有识别能力，充分调动，有效杀灭肿瘤细胞。CIK细胞即细胞因子诱导的杀伤细胞，可通过发挥自身细胞毒性和分泌细胞因子杀伤肿瘤，CIK细胞增殖能力强，细胞毒作用强。两者联合可以显着抑制肿瘤细胞生长、并逐一消灭肿瘤细胞，最大限度调动患者自身的免疫系统对抗肿瘤。更为形象的说，DC细胞像“雷达”，能主动搜索、识别肿瘤细胞，并把信息传递给免疫活性细胞，促进其激活和大量增殖，能提升自身免疫能力；CIK细胞像“精确制导的导弹”，能精确地杀伤肿瘤细胞，而不损伤任何正常组织，能有效地杀灭肿瘤组织或抑制肿瘤生长，特别擅长清除残留、转移微小病灶，防止癌细胞扩散和复发，同时也能够提升机体免疫力。DC细胞和CIK细胞两者联合能确保高效和谐的免疫反应的完成，迅速增强了人体免疫系统，可显改善患者的生活质量，延长肿瘤患者的生存期。如果能得到病人肿瘤组织，制备肿瘤细胞裂解物致敏DC细胞，培养的DC-CIK细胞体内对肿瘤细胞的特异性杀伤能力更强。由骨髓、脐带血或外周血得到的单个核细胞在体外细胞因子和抗体的作用下，被诱导成为DC-CIK细胞。

【注意事项】
①本试剂盒仅限用于以获得DC-CIK细胞为目的的体外诱导处理。
②每一盒试剂只能用于处理一次DC-CIK细胞。开瓶后必须一次性使用，即使处理液有剩余也不能再次使用。
③操作过程要求在万级洁净实验室的局部百级超净工作台内完成，以保证整个诱导处理过程的无菌操作。必须保证操作过程中使用的所有容器及所有直接接触细胞液的器具严格无菌。试剂如出现浑浊、沉淀或絮状物则不能使用。

【储存条件】A（Ⅰ）液、A（Ⅱ）、B液、C液、D液、E液可在2-8℃避光可保存30天，在-20℃以下避光保存12个月。

【适用器具】离心管、移液管、滴管、细胞冻存管等器具要求使用一次性无菌产品。

【样本要求】单个核细胞活性高于90%，其中可含极少量的红细胞。

【使用方法】
①40-60ml抗凝外周血加入一支50ml离心管中，以2000rpm离心20min后，吸取上清血浆备用【上清血浆在56℃水浴锅中
30min灭火，再2000rpm离心20min，吸取上层血清，检菌并保存备用。在培养初期向无血清培养液中加入10%左右的自体血清培养效果更好，培养中后期不需要加自体血清】。
②向吸取上清血细胞的离心管中补加生理盐水到25-30ml，小心混匀。
③取一支50ml离心管，加入15-20ml 医用级淋巴细胞分离液；
④将②混合液小心沿管壁加入③细胞分离液液面上，加入30ml左右混合液，以2000rpm离心20min；
⑤此时离心管中由上至下细胞分为四层。第一层：血浆和生理盐水层，第二层：为环状乳白色淋巴细胞层，第三层：为透明分离液层，第四层：为红细胞层。用3ml巴氏吸管轻轻收集第二层细胞放入50ml离心管中，尽量不吸或者少吸第三层，加入生理盐水，充分混匀后，以1600rpm离心5min，弃去上清留沉淀重新悬起，再重复洗涤2次（最后一次最好用无血清培养液洗涤）既得所需外周血单个核细胞（PBMC）；
⑥离心管中加入20ml培养液（加10%自体血清），轻轻吹打外周血单个核细胞（PBMC），混匀后，取175 cm2细胞培养瓶，加20ml细胞悬液，轻摇铺满培养瓶底，置于CO2培养箱中培养4h，贴壁细胞继续在此瓶中培养DC细胞，加入20ml培养液（加10%自体血清），每瓶加入1mlC液和 1mlD液；20ml非贴壁细胞悬液转入到75cm2细胞培养瓶用于培养CIK细胞，加入B液1支，24h后加入A（Ⅰ）液1支 【用CD3单抗预包被细胞培养瓶的培养方法不同】；
⑦ DC细胞第三天进行半量换液，补加0.5mlC液和0.5ml D液。定时观察CIK细胞，根据细胞形态及培养液颜色确定换液时间及换液量，并补加A（Ⅱ）液【补加原则：①每20ml培养液加入50μl A（Ⅱ）液；②一瓶1000ml无血清培养液加入2.5ml A（Ⅱ）液】；
⑧ DC细胞第6d每瓶加入1mlE液；第7d DC细胞镜检后与CIK细胞共培养；
⑨ DC-CIK细胞培养10-12天，数量达到10×1010个左右，大约8个175cm2细胞培养瓶时，收获细胞并检测细菌、真菌、内毒素，并细胞悬液留样冻存。

【执行标准】 A（Ⅰ）液、A（Ⅱ）、B液、C液、D液、E液《中华人民共和国药典》2010年版三部。