Hieff™ First Strand cDNA Synthesis Kit Hieff™第一条链 cDNA合成试剂盒

保存条件 ： 密封干燥保存

保质期 ： 6个月

英文名 ：Hieff™ First Strand cDNA Synthesis Kit

库存 ： 1000

供应商 ： 钰博生物

Hieff™ First Strand cDNA Synthesis Kit Hieff™第一条链 cDNA合成试剂盒产品描述

HieffTM First Strand cDNA Synthesis Kit基于HieffTM Reverse Transcriptase，该酶热稳定性提高，在50℃的半衰期超过240min，且可长时间耐受高达55℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录，能稳定可靠地合成cDNA。且HieffTM Reverse Transcriptase的独特设计，进一步增强了模板亲和力和行进性，使得全长cDNA的合成能力有了大幅度提升，可获得长达20 kb的cDNA，并且对于常见的逆转录抑制物具有更高的耐受度，非常适合于植物组织RNA的逆转录反应。

本试剂盒包含由总RNA或mRNA合成高质量第一条链cDNA所需的所有成分，并提供两种cDNA合成引物：Random hexamers和oligo（dT）18。合成的单链cDNA产物可直接用来进行后续PCR、qPCR以及PCR克隆。其中，5 × RT Mix包含优化的缓冲体系和dNTP； HieffTMEnzyme Mix包含HieffTM Reverse Transcriptase和RNase inhibitor。可根据需要，选择Oligo (dT)18、Random hexamers或基因特异引物作为逆转录引物。

产品组分

组分编号

组分名称

产品编号/规格

11102ES50（50T）

11102ES72（5×50T）

11102-A

RNase free ddH2O

1 ml

5×1 ml

11102-B

5×RT Mix

200 μl

5×200 μl

11102-C

HieffTM Enzyme Mix*

50 μl

5×50 μl

11102-D

Oligo dT18 (0.5 μg/μl)

50 μl

5×50 μl

11102-E

Random hexamers (N6)

50 μl

5×50 μl

* 包含RNase inhibitor，用于抵抗环境和体系中可能存在的痕量的RNase。

运输与保存方法

冰袋（wet ice）运输。产品在-20 ºC保存。有效期1年。

质量控制

所有组分经检测均无核酸外切酶、核酸内切酶、RNase残留。

功能检测1：以500 ng mouse total RNA为模板，Oligo dT18为引物，50℃反应45分钟。取1/10 cDNA产物进行PCR扩增nebulin基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的20.0 kb条带。

功能检测2：以100 pg Hela cell total RNA为模板，Oligo dT18为引物，50℃反应30分钟。取1/10 cDNA产物进行PCR扩增β-actin基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的550 bp条带。

功能检测3：以500 ng Hela cell total RNA为模板，Oligo dT18为引物，55℃反应45分钟。取1/10 cDNA产物进行PCR扩增Polε基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的4.8 kb (GC-rich)条带。

功能检测4：以1 pg-1 µg HeLa cell total RNA为模板，以Oligo dT18和Random hexamers为引物，测试qRT-PCR性能。

以6个数量级的模板量的对数值对Ct值做标准曲线，R2>0.990，斜率在-3.20到-3.60之间。

客户需要准备的材料

1.RNase free的1.5 ml微量离心管或0.2ml PCR管

2.水浴锅或PCR仪

3.冰

4.RNA（高质量的完整的RNA对于获得高质量的cDNA是至关重要的。

引物选择

1） 如果模板为真核生物来源，建议选择Oligo dT18，其与真核生物mRNA的3’Poly A尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。

2）基因特异性引物 (GSP)的特异性最高。但有些情况下，用于PCR反应的GSP无法有效引导第一链cDNA合成。这时，可改用Oligo dT18或Random hexamers重新进行逆转录。

3）Random hexamers特异性最低，所有RNA，包括mRNA、rRNA、tRNA均可以作为Random hexamers的模板。当目标区域具有复杂二级结构或GC含量较高，或者模板为原核生物来源，使用Oligo dT18或基因特异性引物 (GSP)无法有效引导cDNA合成时，可使用Random hexamers为引物。

Hieff™ First Strand cDNA Synthesis Kit Hieff™第一条链 cDNA合成试剂盒应用实例

1 第一条链cDNA合成*（以20μl反应体系为例）

1）按照下表在RNase free离心管中配制如下混合液：

RNase free ddH2O

to 20 μl

Oligo(dT)18(0.5 μg /μl)

or Random Primer

or Gene Speicific Primers

1 μl

or 1 μl

or 2 pmol

5× RT Reaction Mix

4 μl

HieffTM Enzyme Mix**

0.8-1μl

模板RNA

Total RNA: 50 ng-5 μg/mRNA: 5-500 ng

*可选步骤（一般不需要）：如果RNA模板GC含量丰富或者有复杂二级结构，可以先只加RNA模板、引物和和RNase free H2O混匀，65℃变性5分钟，冰上冷却 5min，短暂离心后加入其它成分继续下面的反转录步骤。

** HieffTM Enzyme Mix非常粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失，用前请瞬时离心后使用，并且避免吸头外壁沾附损失。可每次按照0.8μl使用，不会影响使用效果。

2）用移液枪轻轻吹打混匀。

3）如用Oligo(dT)18或基因特异引物(GSP)，42℃孵育30-50min。

如用Random Primer，25℃孵育10 min，42℃孵育30-50 min。

4）65℃加热15 min(或者85℃加热5 min)失活HieffTM Reverse Transcriptase。

2 RT-PCR

建议取1/10-1/5 体积(2-4 μl)的反转录产物作为PCR模板。

1）建议反应条件

Components

Volume

Final Concentration

cDNA Template

2 μl

as required

Forward Primer (10 μM)

1 μl

0.2 μM each

Reverse Primer (10 μM)

1 μl

0.2 μM each

10×Taq Buffer (含Mg2+)

5 μl

1×

2.5 mM dNTPs

4 μl

0.2 mM

Taq DNA Polymerase

0.5 μl

2.5 units

ddH2O to final volume

50 μl

Not applicable

Hieff™ First Strand cDNA Synthesis Kit Hieff™第一条链 cDNA合成试剂盒

注意事项

1）所有操作均应在冰上进行。

2）除使用RNase free的枪头和离心管外，RNA实验用的试剂建议专用，并在单独的洁净的区域操作。操作时，戴上口罩和一次性手套，避免说话。总RNA提取完成后，建议取少量跑1%琼脂糖凝胶电泳，检验RNA的完整性。

3）逆转录反应抑制物包括酚，盐，SDS，EDTA等。建议用75%乙醇 (用DEPC水配制)仔细洗涤RNA沉淀 (轻弹管底让沉淀悬浮，并静置数分钟)。

4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
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