提供商 ：百翼生物实验室

稳定细胞系筛选

常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中、虽然可以达到高水平的表达，但通常只持续几天。后者也称稳定转染，外源质粒DNA整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期表达目的基因及蛋白。需要在瞬时转染基础上对靶细胞进行筛选或者应用高转染效率的病毒。建立稳定的细胞系，是对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，最常用的真核表达基因载体的标志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin），常用G418进行选择性筛选。筛选得到的细胞可稳定表达目的蛋白，可以用于蛋白的扩增和富集，或者得到稳定沉默特定基因的细胞株。
服务内容：
（1）载体构建或质粒抽提
（2）细胞传代培养、瞬时转染预实验及药物浓度筛选：针对质粒DNA的抗性标志，选择相应的药物，并对所需筛选的细胞进行药物测试，选择细胞全部凋亡时药物的最低浓度。
（3）进行瞬时转染筛选：质粒瞬时转染细胞，并在前期选定的药物浓度条件下进行筛选。10-14天后，挑取单克隆细胞并扩增培养。
（4）细胞扩增后通过RT-PCR检测mRNA表达情况或客户提供靶基因特异性抗体，进行Western Blot检测，根据蛋白表达情况，进一步筛选出稳定细胞株。
数据整理及结果分析。
（1）提供GPCR等药筛细胞系。
（2）提供稳定表达MitoDsRed、GFP-Tubulin、GFP-H2B等细胞株，用于活细胞荧光成像。
客户须知
客户提供构建成功的载体质粒及其它相关载体基因信息、提供细胞系或原代细胞、PCR引物或抗体，所提供材料也可由我公司代购；
一般情况下细胞的瞬时转染效率达到60%以上(绝对细胞数达到10^4以上)，才可顺利进行后续稳定细胞株筛选工作。如果细胞转染率小于60%，也可以做富集筛选，但大部分情况下我们都会建议用流式细胞仪进行细胞分选，此方法既快速又方便，而且可以得到100% 的阳性细胞，一般经过大流式筛选的细胞做后续基因水平或蛋白水平检测都可以得到理想的结果。
服务价格及周期：

服务项目	服务内容	价格	周期
转染预实验及药物浓度筛选	细胞培养、质粒大提、瞬时转染目的细胞并进行药物浓度筛选	3000元	4-6周
单克隆细胞株筛选	筛选稳定表达目的蛋白的单克隆细胞株（可根据需要选取表达量不同的细胞株），因载体及蛋白性质以及表达株数量的不同而异，具体咨询；	4000-12000元	6-8周
RT-PCR检测	RT-PCR检测筛选的细胞系中目的基因的转录水平/至少检测3株	1000元/基因	1周
WB检测	WB检测筛选的细胞系中目的蛋白表达水平/至少检测3株	2000元/膜（或指标）	1周

交付结果：
（1）提供构建成功的质粒及甘油菌及详细的信息
（2）一瓶新鲜的筛选成功的稳定细胞株和相应的对照细胞株
（3）完整的实验报告，包括实验流程、仪器方法、原始数据及图片等