RIP RNA免疫共沉淀技术服务价格

服务名称：RIP

提供商：上海鸿立生物技术有限公司

规格：一个细胞样本一个蛋白

上海鸿立生物技术有限公司拥有稳固的技术平台，高效的服务团队。以技术服务为核心为广大客户提供真实可靠的实验数据，细致入微的服务。

实验原理
使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞核蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质
复合物。该复合物可与链亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过质谱实验检测特定的lncRNA结合蛋白是否与lncRNA相互作用

试剂准备
cold lysis buffer：(胞质蛋白提取裂解液) RNA structure buffer：
1mM PMSF 10 mM Tris pH 7.0
20units Rnasin 0.1 M KCl
10mM Tris-HCl pH 7.4 10 mM MgCl2
10mM NaCl
3mM MgCl2
0.1mM DTT
0.5% NP40

RIP buffer:（胞核蛋白裂解液） nuclear isolation buffer（核提取液）：
150 mM KCl 1.28 M sucrose
25 mM Tris pH 7.4 40 mM Tris-HCl pH 7.5
0.5 mM DTT 20 mM MgCl2
0.5% NP40 4% Triton X-100
1 mM PMSF
protease Inhibitor

实验步骤
细胞数目：5X10^8 cells
胞浆蛋白的提取：
1、细胞消化下来预冷得PBS洗两遍，2000rpm离心4min。反复吹打收集细胞，转移到EP管，2000rpm，2min→弃上清，PBS 重复洗1次。
2、500µl cold lysis buffer重悬沉淀，冰浴10min。
3、5000rpm离心5min，4°C。上清为胞浆蛋白，沉淀为胞核部分。
4、将上清收集至另一EP管，500µl lysis buffer重悬沉淀，冰浴10min，5000rpm离心5min，4°C，弃沉淀，即得到胞核蛋白。
5、若需同时用胞浆及胞核蛋白，将二者等体积混合即可。

胞核蛋白的提取：

收细胞，PBS洗一遍。
2ml PBS+2ml nuclear isolation buffer+6ml 水重悬细胞，冰浴20min。
离心，2500g/4度/15 min，弃上清。
1ML RIP buffer（加入蛋白酶抑制剂）重悬细胞。
超声破碎细胞25个循环左右。
13000rpm离心10min，弃沉淀。

RNA Pull-down

体外转录标记lncRNA 探针（见附录），大约两小时（至浑浊）。
DNase I处理15分钟。
RNA纯化（RNeasy Mini Kit）。
3ug RNA，90度热击，2min。冰上，2min。
加入RNA structure buffer。
转入室温，20min。
将折叠好的RNA与蛋白混合，室温孵育1h。
每个样中加入60ul洗过的磁珠，室温孵育1h。
洗五次。

10、加入SDS buffer，煮沸，进行质谱鉴定。

附：
探针标记：

(1) 2.5mM NTP Mix:

10mM GTP 20μl
10mM UTP 20μl
10mM ATP 20μl
10mM CTP 12μl
10mM Bio-11-UTP8μl

体外转录反应

	Hot	Cold
lineraized DNA (0.5μg/μl)	2μl	2μl
ddH₂O	6μl	6μl
5× buffer	4μl	4μl
NTP Mixs (2.5mM)	4μl	-
RNAsin (40U/μl)	1μl	1μl
100mM DTT	2μl	2μl
10mM NTP Mix	-	各 1μl
T7 pol (20U/μl)	1μl	1μl
37℃，1hr