文献支持HisSep Ni-NTA层析预装柱1ml(中压预装柱) His标签蛋白纯化预装柱

产品描述

HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF以高度交联的6%琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联四配位的氮川三乙酸（NTA）为配体，螯合镍离子（Ni2+）后，形成非常稳定的八面体结构，镍离子处于八面体的中心，这样的结构可保护镍离子免受小分子的进攻，更加稳定，可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件。此外，因其基质的耐压性（该基质可以耐受最高0.3 MPa的压力），该产品可以用于工业大规模蛋白的纯化，可在相对较高的流速下，实现对目的蛋白的纯化。

HisSep Ni-NTA 6FF Chromatography Column是一种以HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF为填料的中压预装柱，该预装柱具有标准接口，可以适配商品化的各类中压色谱系统，如ÄKTA等，方便客户用于纯化His-tag蛋白。

 

产品性质

基质（Matrix）	高度交联的6%琼脂糖凝胶
粒径（Bead size）	45-165 µm
载量（Capacity）	＞40 mg 6×His-tagged protein/mL 基质
耐压（Tolerance Pressuremax）	0.3 Mpa，3 bar
储存缓冲液（Buffer）	含20%乙醇的1×PBS
柱子尺寸（Column Size）	0.7×2.5 cm（1mL）

 

运输和保存方法

冰袋运输。4℃保存。有效期2年。

 

注意事项

1）建议纯化所用缓冲液和蛋白溶液经0.22 µm或0.45 µm滤膜过滤后上柱使用。
2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
3）本产品仅作科研用途！

 

使用方法

（一）纯化流程

1. 缓冲液的准备

缓冲液使用原理：低咪唑上样，高咪唑洗脱，或者高pH上样，低pH洗脱。Buffer 在使用前最好用0.22 µm或0.45 µm滤膜过滤除菌。可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需配方详见附表1。包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方详见附表2。

2. 样品准备

2.1 细菌表达的蛋白（本说明以细菌表达蛋白为例）

1）挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中，根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。
2）表达结束后，将培养液转至离心瓶，7000 rpm，离心15 min，收集菌体，然后加入1/10体积的裂解液（Lysis buffer）和PMSF（PMSF在破碎前加入，其终浓度为1 mM），同时也可加入其他蛋白酶抑制剂，但不能影响目的蛋白与树脂的结合。
3）之后加入溶菌酶，使其工作浓度为1 mg/mL。
注：如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加入溶菌酶。
4）将菌体沉淀悬浮起来（如果菌液浓度高，可考虑加入10 µg/mL RNase A和5 µg/mL DNase I），混匀，置于冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。

5）收集上述澄清蛋白液，10000 rpm，4℃离心20-30 min。取上清，0.22 µm/0.45 µm滤膜过滤后，置于冰上备用或-20℃保存。

2.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白

将细胞培养液转移至离心瓶，5000 rpm离心10 min，收集上清。如上清中不含EDTA、组氨酸和还原剂等，即可直接上柱纯化；如含有EDTA、组氨酸和还原剂等物质，则需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。

注：对于大量体积的上清，需加入硫酸铵进行沉淀浓缩，之后经1×PBS 4℃下透析后上柱。

2.3 包涵体蛋白纯化（以细菌为例）

1）将培养液转移至离心瓶，7000 rpm，离心15 min，收集菌体去上清。

2）按照菌体：裂解液=1:10（w/v）的比例将菌体充分悬浮，混匀，冰浴超声破碎。

3）将破碎液转移至离心管，10000 rpm，4℃离心20-30 min，去上清。可重复步骤2）和3）一次。

4）按照菌体：裂解液（含8 M尿素）=1:10（w/v）的比例将包涵体充分悬浮。

5）变性条件下纯化His标签蛋白纯化。

3. 样品纯化（以AKTA使用为例）

1）将泵管道注满去离子水。去掉产品上塞，连接至色谱系统中，再折断下口，将预装柱连接到色谱系统中，注意旋紧。

2）3-5倍柱体积去离子水冲洗出存储缓冲液。

3）至少5倍柱体积的Lysis Buffer 平衡色谱柱。推荐流速为1 mL/min。
4）利用泵或注射器上样。
注：若样品粘度增加，即使上样体积很少也会导致层析柱很大的反压；上样量不要超过柱子的结合能力；大量的样品体积也可能造成很大的反压，使得进样器更难使用。

5）Wash Buffer 平衡柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线（一般至少10-15个柱体积）。

注：在样品和结合缓冲液中加入低浓度咪唑可以提高样品纯度。
6）Elution Buffer一步法或梯度法进行洗脱。一步法洗脱中一般5倍柱体积洗脱液即可。梯度洗脱可以用一个小的梯度，例如20倍柱体积或更多来分离不同结合强度的蛋白质。
7）建议用更高浓度咪唑（如500 mM）彻底清洗纯化柱上结合的杂蛋白。随后依次用3倍柱体积的Lysis Buffer和5倍柱体积的去离子水清洗树脂。5倍柱体积的20%乙醇平衡树脂，置于4℃保存。

4. SDS-PAGE检测

将纯化过程中得到的样品（包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等）利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。

（二）在位清洗

当填料使用过程中发现反压过高（＞0.5 Mpa）或者填料上面出现明显的污染时，需对其进行在位清洗（Cleaning-in-Place，CIP）。在位清洗时，先把Ni²⁺脱掉，清洗结束后，将填料保存在20%乙醇中，后者重新挂Ni后再保存在20%乙醇中。建议按照下面操作去除填料上残留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

1 去除强疏水结合的蛋白，脂蛋白和脂类

使用30%异丙醇清洗5-10个柱体积，接触时间为15-20 min可以去除此类污染物。之后再用去离子水清洗10倍柱体积。也可以选择使用含有去污剂的酸性或者碱性溶液清洗填料2倍柱体积。例如含有0.1-0.5%非离子去污剂的0.1 M醋-酸溶液，接触时间为1-2 h。去污剂处理后，需用70%的乙醇清洗5倍柱体积，彻底去除去污剂。最后利用去离子水清洗10倍柱体积。

2 去除离子作用结合的蛋白

使用1.5 M NaCl 溶液接触10-15 min，之后用去离子水清洗10倍柱体积。

（三）填料再生

当填料使用过程中发现反压过高（＞0.5 Mpa），填料上面出现明显的污染，或填料载量明显变低时，需要对其进行镍离子剥离及重新挂镍处理，即填料再生。按照下面操作流程进行：

 

1）使用5倍柱体积去离子水清洗填料；

2）使用5倍柱体积100mM EDTA（pH 8.0）剥落镍离子；

3）使用10倍柱体积去离子水清洗填料；

4）使用0.5M NaOH清洗5倍柱体积，停留10-15min；

5）使用10倍柱体积去离子水清洗填料；

6）使用3-5倍柱体积100mM NiSO₄再生挂镍；

7）去离子水清洗10倍柱体积。

填料再生后，可立即使用，也可保存在20%乙醇中，置于4℃备用。

附表1 可溶性His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

缓冲液名称	配方	配制1L溶液所需各种试剂量
Lysis Buffer (pH8.0)	50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM imidazole NaOH调pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm过滤除菌	NaH2PO4 ·2H2O 7.8 g NaCl 17.54 g Imidazole 0.68 g
Wash Buffer (pH8.0)	50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 20 mM imidazole NaOH调pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm过滤除菌	NaH2PO4 ·2H2O 7.8 g NaCl 17.54 g Imidazole 1.36 g
Elution Buffer(pH8.0)	50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 250 mM imidazole NaOH调pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm过滤除菌	NaH2PO4 ·2H2O 7.8 g NaCl 17.54 g Imidazole 17.0 g

 

附表2 包涵体His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

缓冲液名称	配方	配制1L溶液所需各种试剂量
Lysis Buffer，pH8.0	8 M Urea 100 mM NaH2PO4 100 mM Tris·HCl 盐酸溶液调pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm过滤除菌	Urea 480.5 g NaH2PO4 ·2H2O 15.6 g Tris 15.76 g
Wash Buffer，pH6.3	8 M Urea 100 mM NaH2PO4 100 mM Tris·HCl 盐酸溶液调pH至6.3，0.22 µm或0.45 µm过滤除菌	Urea 480.5 g NaH2PO4 ·2H2O 15.6 g Tris 15.76 g
Elution Buffer，pH4.5	8 M Urea 100 mM NaH2PO4 100 mM Tris·HCl 盐酸溶液调pH至4.5，0.22 µm或0.45 µm过滤除菌	Urea 480.5 g NaH2PO4 ·2H2O 15.6 g Tris 15.76 g

 

附表3 HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF试剂耐受情况

试剂种类	浓度
还原剂	5 mM DTE 0.5-1 mM DTT 20 mM β-mercaptoethanol 5 mM TCEP 10 mM reduced glutathione
变性剂	8 M urea 6 M Gua-HCl
去污剂	2% TritonTM X-100(nonionic) 2% TweenTM20(nonionic) 2% NP-40(nonionic) 2% Cholate (anionic) 1% CHAPS (zwitterionic)
其他类	500 mM imidazole 20% ethanol 50% glycerol 100 mM Na2SO4 1.5 M NaCl 1 mM EDTA 60 mM citrate
缓冲液	50 mM sodium phosphate，pH 7.4 100 mM Tris-HCl，pH 7.4 100 mM Tris-acetate，pH 7.4 100 mM HEPES，pH 7.4 100 mM MOPS，pH 7.4 100 mM sodium acetate，pH 7.4

 

附表4 问题及解决方案

问题	可能原因	推荐解决方案
柱子反压过高	填料被堵塞	裂解液中可能含微小的固体颗粒，建议上柱前使用滤膜（0.22 µm或0.45 µm）过滤，或离心去除。
		样品中含高浓度的核酸，延长破碎时间直至粘度降低，或添加DNaseI （终浓度为5 µg/mL），Mg2+(终浓度1 mM)，冰上孵育10-15 min
	样品太黏稠	有机试剂或蛋白稳定试剂（如甘油等）可能会引起反压增高，降低操作流速。
洗脱组分中无目的蛋白	蛋白可能是包涵体	可通过电泳检测裂解液，分析上清中是否有目的蛋白，包涵体蛋白需按照包涵体蛋白的纯化方式
	表达量太低	优化表达条件，使用包涵体纯化缓冲体系
	目的蛋白结合比较弱，在洗杂步骤中已被洗下来	提高Wash Buffer的pH值，或者降低咪唑浓度
	目的蛋白结合过强，不容易洗脱下来	降低Elution Buffer的pH，或者增加Elution Buffer中的咪唑浓度
		使用10-100 mM EDTA溶液剥离镍离子，同时得到蛋白
	蛋白降解	菌体破碎时需添加一些蛋白酶抑制剂
		在4℃下进行纯化操作
洗脱组分不纯（含多种蛋白）	洗杂不彻底	增加Wash Buffer 体积
	样品中含有其他His标签蛋白	通过调节pH值或咪唑浓度来优化洗杂条件。再使用其他纯化手段（如去离子交换，疏水等）进一步纯化洗脱组分。
填料颜色变浅或变成白色	镍离子脱落或者剥离	按照填料再生的操作重新挂镍离子
填料呈现褐色	缓冲液中含有DTT等还原剂	参考附3适当降低还原剂DTT的浓度，或改用巯基乙醇
上样过程中蛋白发生沉淀	操作温度太低	室温下进行上样
	蛋白发生聚集	在样品和所有缓冲液中添加稳定剂，如0.1%Triton X-100或Tween-20

 

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HB 180820