研选miRNA靶基因的预测与验证(双荧光素酶）| 双荧光素酶报告基因（DLR）检测| 海肾-海萤双荧光素酶（dualluciferase报告基因）

　　miRNA主要通过与靶mRNA的结合，或促使mRNA降解，或阻碍其翻译，从而抑制目的基因的表达。用生物信息学方法准确快速地预测miRNA的靶基因，可以为研究miRNA功能提供线索。
　　金开瑞提供miRNA靶基因的预测与验证相关课题服务，通过荧光报告素酶活性检测，结合软件预测及蛋白验证，提高靶点预测的精确性及可行性。

双荧光素酶实验应用

1.验证microRNA与靶基因（mRNA/lncRNA/circRNA）的互作

miRNA与靶基因结合后抑制靶基因的翻译，从而导致萤火虫荧光素发光值下降；当结合位点被突变后荧光值较对照组无差异性变化，证明miRNA是通过结合位点调控靶基因。

2.验证启动子与转录因子的互作

启动子和转录因子结合后萤火虫荧光素酶表达增强，从而导致荧光素发光值上升；当结合位点被突变后荧光值较对照组无差异性变化，证明启动子与转录因子有结合。

3.启动子结构分析

将启动子区域序列（通常2k左右）进行分段截短，或对特定位点进行突变，再分别构建入luciferase报告载体，检测其启动子活性。

4.启动子SNP分析

一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用荧光素酶报告系统分析相对活性。

5.验证通路是否激活

将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体，在不同上游信号条件下，萤光素酶活性代表了通路的下游响应。例如，在GPCR研究中，将cAMPresponseelement（CRE）载入报告基因载体，构建稳定表达细胞株后，可以用于分析GPCR的激活与抑制剂筛选。又如，将HIF1α的响应原件hypoxia-responsiveelement (HRE)插入luciferase报告载体构建稳转细胞株，可用于低氧相关通路的研究。


案例展示

图.双光素酶和RIP验证lncRNA可以与miR-26a结合（引自CCao, Zhang T, Zhang D. et al.The long noncoding RNA, SNHG6-003,functions as a competing endogenous RNA to promote the progression ofhepatocellular carcinoma. Oncogene. 2017 Feb 23;36(8):1112-1122.）

服务内容
1、靶基因预测：使用软件对miRNA的靶基因进行预测或者根据靶基因对作用的miRNA进行预测；
2、质粒构建：提供miRNA mimics或者构建pri-miRNA质粒或者慢病毒、腺病毒病毒包装；提供miRNA inhibitor或者构建miRNA干扰质粒或者慢病毒、腺病毒病毒包装；构建靶基因的3’UTR野生型和突变型荧光素酶报告基因质粒
3、细胞转染：将构建好的质粒和提供的miRNA mimics或者miRNA inhibitor分组共转染293T等工具细胞
4、荧光素酶检测：使用双荧光素酶或者单荧光素酶试剂盒检测荧光素酶活性，从而获得miRNA对靶基因的作用数据。
客户提供
1、提供miRNA名称或miRNA mimics化合物
2、Gene ID 或者基因3’UTR序列信息
最终交付
1、靶基因3‘UTR载体的测序结果及载体构建实验报告
2、靶点验证实验数据及实验报告
服务周期
3-4周

• 引用文献

[1]Yang Min,Chen Jinpeng,Li Xinshuai,Huang Jianling,Wang Qing,Wang Shaowen,Wei Shina,Qin Qiwei. The transcription factor NFYC positively regulates expression of MHCIa in the red-spotted grouper (Epinephelus akaara)[J]. Developmental and Comparative Immunology,2022,127.