供应商 ：上海笃玛生物科技有限公司
检测限 ：电询
检测方法 ：ELISA
应用 ：电询
适应物种 ：人
标记物 ：电询
样本 ：血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清、组织匀浆等
规格 ：48T/96T
原理
试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联吸附试验（ELISA）。往预先包被相关指标的抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的相关指标呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。
注意事项
1. 试剂盒保存于2-8℃，切勿反复冻融或长时间保存于室温。
2. 实验前确保所有试剂均已恢复至室温。
3. 加样时注意避免产生气泡。
4. 洗涤时要充分洗涤，避免残留物影响实验结果。
5. 底物溶液应避光保存，避免长时间暴露于空气中。
6. 酶标仪应使用450nm波长进行读数，其他波长可能导致误差。
7. 本试剂盒仅用于科研实验和诊断参考，不适用于临床诊断和治疗。
试剂盒组成
| 试剂盒组成 |
48孔配置 |
96孔配置 |
保存 |
| 说明书 |
1份 |
1份 |
|
| 封板膜 |
2片（48） |
2片（96） |
|
| 密封袋 |
1个 |
1个 |
|
| 酶标包被板 |
1×48 |
1×96 |
2-8℃保存 |
| 标准品 |
0.5ml×1瓶 |
0.5ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
| 标准品稀释液 |
1.5ml×1瓶 |
1.5ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
| 酶标试剂 |
3 ml×1瓶 |
6 ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
| 样品稀释液 |
3 ml×1瓶 |
6 ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
| 显色剂A液 |
3 ml×1瓶 |
6 ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
| 显色剂B液 |
3 ml×1瓶 |
6 ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
| 终止液 |
3ml×1瓶 |
6ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
| 20倍浓缩洗涤液 |
20ml×1瓶 |
23ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
操作步骤
1. 样品收集与处理
（1）根据需要收集不同种类的样品，如血清、血浆、尿液等。
（2）对于血清和血浆样品，将采集的血液静置一段时间后，离心分离出血清或
血浆。
（3）对于尿液样品，收集尿液后，可直接进行检测。
2. 样品稀释
根据试剂盒说明，对需要稀释的样品进行适当比例的稀释。
3. 加样
（1）按照试剂盒说明，分别将标准品、质控品和待测样品加入相应的孔中。
（2）每孔加入50μL，轻轻震荡混匀。
4. 封闭
根据试剂盒说明，加入适量的封闭液，覆盖板孔，并轻轻震荡混匀。封闭液一
般
为含有一定浓度的非特异性结合配体的溶液，可以降低非特异性结合的影响。
5. 洗涤
（1）将板孔洗涤液加入到每个孔中，轻轻震荡，然后倒掉洗涤液。重复洗涤3
次，
每次用洗涤液充分洗涤
（2）一次洗涤后，用纸巾轻轻吸干板孔表面的水分。
6. 酶标二抗加入及孵育
（1）根据试剂盒说明，将酶标二抗加入相应的孔中。
（2）孵育一定时间后，将板孔中的溶液倒掉。
7. 洗涤与显色
（1）重复步骤5的洗涤过程。
（2）加入显色剂，孵育一定时间后，将板孔中的溶液倒掉。
8. 终止反应与读数
（1）加入终止液，终止酶促反应。
（2）用酶标仪在450nm波长处读取各孔的光密度值（OD值）。
结果分析
根据试剂盒提供的标准品浓度及对应的OD值，利用标准品绘制的标准曲线，计算待测样品的浓度。一般采用拟合曲线法或直线回归法进行数据处理，通过计算得到待测样品的浓度。
该产品被引用文献
该产品被引用文献
标本的采集及保存
1.血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过一晚后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2.血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3.细胞培养物上清或其它生物标本：1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 (注：标本溶血会影响**检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。)
标本的稀释原则：首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中，应做好详细的记录。计算浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。
标准品的稀释原则：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为300 pg/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释300 pg/ml，150 pg/ml，75 pg/ml，37.5 pg/ml，18.5 pg/ml，9 pg/ml，4.5 pg/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0 pg/ml，临用前15分钟内配制。 如配制150 pg/ml标准品：取0.5ml（不要少于0.5ml）300 pg/ml的上述标准品加入含0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
生物素标记抗体的稀释原则：临用前以生物素标记抗体稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100μl），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素标记抗体加990μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则：临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100μl），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根过氧化物酶标记亲和素加990μl辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
操作步骤
实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。
1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。 为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液 100μl（取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。
3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。
4.每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液） 100μl，37℃，60分钟。
5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。
6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。
7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。
8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。 在加终止液后15分钟以内进行检测。
注意事项
1.用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。
2.每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是加底物溶液及2N 。测量时先用此孔调OD值至零。
3.为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。
4.未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记抗体工作液或、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。
5.建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
计算
以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项
1.当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。
2.洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
3.一次加样时间**控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4.请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。
5.如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请乘以稀释倍数。
6.在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。
7.底物请避光保存。
8.不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。
注意事项：收集标本前必须清楚要检测的成份是否足够稳定。对收集后当天进行检测的标本，储存在4 ℃备用，如有特殊原因需要周期收集标本， 将标本及时分装后放在-20 ℃或-70 ℃条件下保存。避免反复冻融。标本2 -8 ℃可保存48 小时，-20 ℃可保存1 个月。-70度可保存6 个月。部分激素类标本需添加抑肽酶。
计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
试剂盒性能
1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.92以上。
2.批内与批见应分别小于9%和15%
相关实验
Ca2+/钙调蛋白依赖性激酶分析实验
蛋白激酶的分析是使用标记的供体底物，当酶样品中含有磷酸转移酶活性时，蛋白 质或多肽受体底物中标记物的积累就很容易被检出。
内容来源于《精编分子生物学实验指南（第五版）》
怎样选择ELISA 试剂盒？
目前市场上的 ELISA 试剂盒质量参差不齐，如何去挑选适合自己的试剂盒就显得特别重要，具体有以下几点可供参考。特异性ELISA 试剂盒的特异性与试剂盒的关键组分，抗体对有关。若抗体对中之一为多抗，另一个必须为单抗，建议使用双单抗。灵敏度灵敏度反映的是试剂盒检出被检物质的最低量的能力，用户
环核苷酸依赖性蛋白激酶分析实验
蛋白激酶的分析是使用标记的供体底物，当酶样品中含有磷酸转移酶活性时，蛋白 质或多肽受体底物中标记物的积累就很容易被检出。
内容来源于《精编分子生物学实验指南（第五版）》
