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文献和实验
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服务名称 :Pull down实验技术服务
提供商 :辉骏生物
一.Pull down 的概念—辉骏生物
在Pull down实验中,带有标签的诱饵蛋白被特异结合该标签的固相化亲和配基捕获,产生“次级亲和支持物”,用于纯化与诱饵蛋白相互作用的其他蛋白。固相化诱饵蛋白的次级亲和支持物可以与含有推测猎物蛋白的各种蛋白样品相互孵育,如果缓冲液及样品条件与靶结合相互作用兼容,且诱饵蛋白在带有标签和被固相化时仍然可以行使功能,那么存在于样品中的猎物蛋白就会结合到亲和支持物上,“诱饵-猎物复合体”可从支持物上洗脱下来。
二.Pull down实验流程—辉骏生物
图1. Pull down流程示意图
三.Pull down实验方案设计—辉骏生物
1.构建带标签的诱饵蛋白原核表达载体(带his或GST标签);
2.载体转化大肠杆菌,表达诱饵蛋白(这一步比较关键,很多蛋白原核表达会形成包涵体,极大影响后续实验,我们采用自诱导培养基培养细菌,使得包涵体形成的几率大大降低);
3.细菌裂解液过柱子,带标签的诱饵蛋白被特异结合标签的固相化亲和配基捕获,产生“次级亲和支持物”;
4.待测样品裂解液过柱子孵育,与诱饵蛋白互作的蛋白被“次级亲和支持物”吸附;
5.清洗,离心,去除未结合的杂蛋白;
6.洗脱,得到诱饵蛋白及其互作蛋白的复合物;
7.如要验证某个蛋白X与诱饵蛋白互作,则将6.所得的蛋白复合物与X蛋白的抗体孵育,做Western blot验证;
8.如要寻找诱饵蛋白可能的互作蛋白,则将6.所得的蛋白复合物进行LC-MS/MS鉴定;图2. Pull down实验流程
图2. Pull down实验方案图
四.生物信息学分析—辉骏生物
五.Pulldown实验技术服务内容—辉骏生物
- 原核表达载体构建;
- 原核表达与蛋白纯化;
- pull down捕获互作蛋白;
- Western blot验证或LC-MS-MS鉴定;
- 数据检索、生物信息学分析;
- 结果提交。
六.订购pull-down技术服务须知—辉骏生物
- 技术服务咨询:在您开始实验之前,本公司将为竭诚您提供给类科学、严谨的pull down实验设计方案。
- 为了保证pull down实验能顺利进行,客户应提供正确的目的蛋白序列或者基因登录号、拟用标签。
七.实验周期及费用:咨询辉骏生物。
电话:400-699-1663
邮箱: service@fitgene.com
官网:www.fitgene.com
地址:广州市黄埔区科学城广州国际企业孵化器D506
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