microRNA芯片技术服务

服务名称 ：microRNA芯片技术服务

提供商 ：上海虹舜生物科技有限公司

规格 ：每个样本

microRNAs(miRNAs)是是单链的短RNA，长度在22nt左右。 microRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体（RISC）降解mRNA或抑制mRNA的翻译，从而在转录后水平调控蛋白表达（最新发现 microRNA也能在转录水平调控基因表达）。microRNA在物种进化中相当保守，在动物、植物和真菌等中发现的microRNAs表达均有严格的 组织特异性和时序性。microRNA在细胞生长和发育过程中起多种作用，包括调控发育、分化、凋亡和增殖等；在疾病的发生发展全过程中，也发挥重要的调控作用。 虹舜生物为您提供microRNA芯片技术服务，您只需要提供保存完好标本及标本信息，虹舜生物为您完成全部实验操作，包括RNA抽提及质检、标记、杂交和数据分析，最终为您提供完整的实验报告。 安捷伦科技有限公司（Agilent Technologies Inc.）作为国际领先的生物芯片制造企业，利用其先进的芯片生产工艺，开发出具 有独特设计的miRNA检测芯片，能特异性地检测出成熟的miRNA并能很好地区分高度同源的miRNA 分子。可以广泛地应用于检测和比较各类样品的miRNA表达状态。 miRNA芯片产品： 物种 产品名称 产品描述 人 Human Agilent Human miRNA （8*60K） 可检测2006个人成熟miRNA 小鼠Mouse Agilent Mouse miRNA （8*60K） 可检测1247个小鼠成熟miRNA 大鼠Rat Agilent Rat miRNA（8*15K） 可检测719个大鼠成熟miRNA miRNA芯片技术特点： 1.特殊的探针设计，唯一区分成熟miRNA和miRNA前体； 2.无需分离miRNA，样品需求量低，只需100ng 3. 高特异性：特殊的专利探针设计能区别一个碱基的差异 4. 高灵敏度：检测丰度跨5个log，有利于检测到更宽丰度范围的miRNA 5. 高重复探针，每个miRNA至少重复20次 miRNA芯片技术服务流程： 1. 样品RNA抽提 a. 实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，使用 BioPulverizerTM冰冻粉碎组织，加1ml的RNA抽提试剂TRIzol（Invitrogen），使用Mini-Bead-Beater- 16匀浆后抽提RNA。 b. 实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，加1ml的RNA抽提试剂TRIzol（样品为贴壁细胞，每10cm2培养皿TRIzol使用量为1ml），裂解后抽提RNA。 2. RNA 质量检测 a. 使用Nanodrop测定RNA 在分光光度计260nm 、280nm和230nm的吸收值，以计算浓度并评估纯度。 b. 用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA 纯度及完整性。 c. 提供RNA QC报告。 注意：用于芯片检测的RNA样品，必须是高质量的，完整的，没有RNase污染（降解的样品不能用于标记和芯片检测），没有基因组污染。 3. 制备荧光标记探针 采用标记试剂盒，用标记酶将Hy3™或Hy5™荧光基团标记miRNA, 可以得到用于与芯片杂交的荧光探针。 4. 芯片杂交 在标准条件下使用杂交仪将标记好的探针和芯片杂交。 5. 图像采集和数据分析 使用芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，并将实验结果转换成数字型数据保存，使用配套软件对原始数据进行分析运算。 6. 提供实验报告—— 包括详细的实验方法和芯片实验数据及图表 a. 芯片扫描图 b. 操作说明（含RNA质检报告） c. 芯片数据 数据汇总表格（EXCEL格式，包含探针位置，探针名称，原始信号值，修正信号值，标准化信号值，样品间microRNA表达量的比值） 差异表达microRNA的数据表格（EXCEL格式，包含表达上调2倍的microRNA和表达下调2倍的microRNA） d. 进一步数据分析 Scatter Plot（主要针对单色重复实验数据进行相关性R值计算） 分层聚类（进行多个样品实验时，按基因表达相似程度进行聚类，从而将多个样品进行归类） 若进行重复实验（≥3）则计算CV值、p值，并做Volcano Plot。 miRNA芯片数据分析 ： 1.标准化 microRNA芯片采用的标准化的方法为quantile normalization，loess normalization。 2. 差异基因筛选 通过标准化后的信号值计算出每个miRNA在不同样品间（如处理组 vs 对照组）的表达变化（fold change），并通过ttest计算样品间miRNA表达量变化的统计学显著性。那些表达变化倍数在2倍以上，p值小于0.05的miRNA被挑选出 来，并定义为显著性差异表达的miRNA。针对多重比较，p值被校正为FDR。客户可以根据倍数变化，p值，FDR等参数对差异表达的miRNA进行排序 和筛选。 适用范围：两组或多组样品间的比较，建议每组样品数目大于或等于3 *图释：样品间差异表达的miRNA数据示例。 3.差异表达miRNA的聚类图 层次聚类是一种最常见的用于分析表达数据的聚类方法。它可以根据样品中基因的表达水平将样品自动的分组，可以从整体上评估样品间的基因表达差异，以及样品间的关系。 适用范围：两组或多组样品的miRNA表达谱分析 *图释：不同样品组之间差异表达miRNA的聚类示例。 4. miRNA靶基因预测 microRNA结合在靶基因的3’ UTR，下调靶基因．miRNA靶基因预测有多种方法．我们利用TargetScan数据库关联microRNA的靶基因。 *图释：miRNA 进行靶基因预测的结果示例。

miRNA芯片样品准备：
一、动物组织样品保存与运输（每张芯片需50-100mg组织）
1、新鲜组织样品的保存与运输
A、使用RNAlater试剂

• 取新鲜组织（注：生物体死亡后尽快在10分钟内取材），组织块以PBS或生理盐水清洗干净，所用组织必须切至厚度在0.5 cm以下（长宽不限），然后放入装有5倍体积RNAlater的离心管（或冻存管）中。
• 4℃孵育过夜，此时样品管需要横置以便组织块充分接触到RNAlater，然后转入- 20℃中保存。样品在- 20℃不会冻结，但是溶液中可能有一些晶体出现，这并不影响后续的RNA抽提。冻存样品也可以反复冻溶，其RNA含量和完整性不受影响。
• RNAlater处理的标本可用常规冰袋4℃低温运输（无需使用干冰- 70℃运输）。

B、使用Trizol试剂
Trizol试剂可抑制RNA酶活性，破坏细胞膜结构以裂解细胞释放出RNA。

• 取新鲜组织（注：生物体死亡后1分钟内取材料并保存好），组织块以PBS或生理盐水清洗干净，每50~100 mg组织加1 ml Trizol溶液匀浆裂解组织样品，操作最好在冰上进行。
• 匀浆的裂解液4℃短期保存（1个月），-20度或- 70℃长期保存。干冰运输，短期（5天以内）冷藏（4℃）运输亦可。

2、冻存组织的保存与运输
生物体死亡后尽快（最好在10分钟内）切取新鲜组织，以PBS或生理盐水清洗干净切为小块，立刻放入液氮中冷冻2-3小时后可转入-70℃冰箱保存或着一直保存在液氮中。冻存组织可放入干冰中直接运输，或者以Trizol 4℃下匀浆： 冻存的组织块以液氮研磨后加Trizol或直接加Trizol以电动匀浆器匀浆，匀浆的裂解液干冰运输或短期（5天以内）冷藏（4℃）运输。

二、哺乳动物培养细胞样品采集、保存与运输——使用Trizol试剂（不建议使用RNAlater）
1、悬浮细胞

• 悬浮细胞培养液倒入离心管中，离心沉淀细胞，弃去上清液。
• 细胞沉淀（1×10⁷个细胞）中加入1 ml的Trizol裂解液。
• 反复吸打几次后，目视可见细胞层溶解完全。- 70℃保存或干冰运输。注：Trizol处理的标本冷藏（4℃）运输，短期（5天以内）亦可。

2、贴壁细胞

• 从培养容器中吸出并弃去培养液。
• 培养瓶中直接加入Trizol试剂，Trizol用量与细胞贴壁面积有关，约15 cm²细胞贴壁面积加入1 ml Trizol。
• 反复吸打几次后，目视可见细胞层溶解完全。- 70℃保存或干冰运输。注：Trizol处理的标本冷藏（4℃）运输，短期（5天以内）亦可。

注：
1、本市内细胞样品也可以直接常温运送，运送时在培养瓶中装满培养液并以封口膜封口，然而某些实验条件中包含时间限制，建议以Trizol处理。
2、所使用的1.5 ml冻存管或离心管、枪头等必须高温灭菌，装好样品后管口需要以封口膜封好。
3、如需干冰，快递运输所用干冰量至少为8公斤，且运输用泡沫箱需用封箱带密封。