microRNA靶基因技术服务

服务名称 ：荧光素酶报告基因检测实验

提供商 ：上海虹舜生物科技有限公司

当前，microRNA对靶基因的功能研究十分热门。利用荧光素酶报告基因检测实验寻找或验证microRNA对靶点作用性是不可或缺的实验技术。由于microRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用，可以将目的基因3’UTR区域构建至载体中报告基因luciferase的后面，通过比较过表达或者干扰microRNA，报告基因表达的改变可以定量反映microRNA对目的基因的抑制作用；结合定点基因突变等方法进一步确定microRNA与靶基因3’UTR的作用位点。

	虹舜生物为您提供microRNA靶基因技术服务，您只需要提供目的microRNA靶位点序列，虹舜生物就可为您完成microRNA报告基因载体构建，荧光素酶报告基因检测实验，提供给您完整的实验报告。

下图为microRNA-reporter载体表达框架示意图，具有多克隆位点，方便插入目的靶点序列。psiCHECK-2载体用于终点法的细胞裂解物 检测，包含萤火虫荧光素酶基因，使海肾荧光素酶的表达水平归一化，令该系统更可靠、重现性更好。使用psiCHECK-2载体时，无须通过共转染进行归一 化。


microRNA报告基因实验流程：
1、microRNA靶点的预测
利用Targetscan,miRanda,PicTar软件得到目的microRNA的预测靶点序列(客户提供)。
2、 获得microRNA靶点序列
根据提供的靶序列，合成两条互补的单链DNA模板。或者，设计引物PCR扩增目的microRNA靶基因3’UTR序列。
3、 3’UTR克隆及载体构建
将合成的两条单链退火成双链（具有粘性末端），或将PCR产物双酶切，后连入经过同样双酶切的psiCHECK-2载体中，连接产物转化大肠杆菌DH5α。
4、3’UTR突变实验
构建psiCHECK-UTR-mut载体（含突变靶位点的荧光素酶报告基因载体）
5、 阳性克隆鉴定。
挑选转化的菌落，PCR筛选含有插入片段的阳性克隆，测序验证克隆的序列和目的microRNA靶序列一致。
6、 细胞转染准备
将含目的microRNA靶基因的野生型psiCHECK-UTR载体、psiCHECK-UTR-mut载体和microRNA　mimics或microRNA negative control共转染293T或Hela细胞。
7、荧光素酶检测
共转染细胞24-72h后，进行双荧光素酶检测，确定目的microRNA的靶基因。
8、整理分析数据，得出结论。
提供有microRNA靶序列的pisCHECK质粒及甘油保存菌株各一支。附实验报告，包括载体构建过程，鉴定记录，测序报告，细胞转染，荧光检测。

注：
microRNA　mimics与microRNA negative control由客户提供或由本公司代购，也可选用Pre-miR 与Pre-miR negative control（Ambion）或构建microRNA过表达载体及对照载体（本公司可以构建，费用另计）。