siRNA的细胞转染及筛选

服务名称 ：RNAi设计及筛选实验服务

提供商 ：锐赛生物

实验原理
继植物中发现基因沉默现象后，动物细胞中的双链RNA诱导的基因沉默现象也被阐明，并于2006年获得诺贝尔医学奖的肯定，足以说明RNAi技术在医学领域即将发挥的开创性作用。siRNA（Small interfering RNA)是21-25核苷酸的小分子RNA，由Dicer酶加工双链RNA而成。siRNA与体内多种酶类结合形成RNA诱导的沉默复合物（RISC），从而激发与之互补的目标mRNA的降解。天然的RNAi现象存在于包括人类在内的动植物体内，在调节基因表达和预防病毒感染方面起到重要作用。

实验流程

实验结果展示

图1 相对定量 PCR 检测 3 组 siRNA 转染组相对阴性对照组目的基因的干扰效果

TROUBLESHOOTING

实验问题	原因	推荐解决方法
荧光标记的阴性对照siRNA无可见荧光？	转染效率不高	保证细胞状态良好；选择合适的转染试剂，调整转染试剂siRNA的比例；避免培养基中含有抗生素；适当延长观察时间。
siRNA转染实验阳性对照和靶基因均无干扰效果?	转染体系	提高转染效率，模式siRNA的使用浓度，注意实验操作防止RNA每污染。
阳性对照有效而靶基因的siRNA转染无干扰效果？	干扰靶点无效	设计多对siRNA片段进行尝试，选择干扰效率最高的靶点。
同一对siRNA在不同细胞中干扰效果不同？	不同细胞特性不同	转染效率相近，不同细胞核酸酶的活性高低也会影响siRNA的代谢速度，导致沉默效果出现差异。
	本底表达丰度不同	本底表达丰度很高或很低对干扰效果都有影响。
	转染效率不同	优化转染方式，提高转染效率。

常见问题FAQ
Q：化学合成siRNA的结构？
A：化学合成的siRNA为正义链和反义链双链结构，正义链与靶序列相同，通常为19个核苷酸。另外正义链和反义链的3‘端均含有dTd的悬垂，脱氧核糖核苷可保护siRNA免受降解。客户未有验证靶点的情况下建议一次合成3对以上的siRNA进行筛选工作。

Q ：化学合成的siRNA有哪些可选种类？特点有哪些？

种类	特点
化学合成siRNA	无修饰和荧光标记，合成方便快捷，价格便宜。
化学修饰siRNA	对正义链进行化学修饰更加稳定，延长了作用时间。
荧光标记siRNA	对正义链进行荧光标记（如CYC3）后可通过观察荧光优化转染条件，也便于对siRNA进行定位追踪。

Q：细胞转染实验的siRNA推荐浓度是多少？
A：细胞转染实验的终浓度建议采用50-100NM，浓度过高导致细胞毒性。对于21bp的siRNAoligo，有如下简单关系：20D=6.0nmol=80ug。一般购买20D包装的siRNA，可采用DEPC水配成母液后使用前稀释。

Q：实验中采用阴性对照和阳性对照siRNA的目的？
A：由于高浓度的siRNA有可能导致非常异性的干扰结果，因此必须设置阴性对照，建议使用通过的带有荧光标记的阴性对照siRNA；将靶序列打乱之后的阴性对照siRNA，未经验证，有可能引起off-target现象。阳性对照可以确保实验中的操作无误，如转染操作，RNA抽提方法以及qPCR检测结果都是可信的。

Q：化学合成的siRNA靶点序列将来可否用于构建shRNA质粒载体和病毒包装？
A：已确认干扰效果的siRNA靶点可以进行shRNA质粒载体的构建个病毒包装工作，但毕竟表达体系不同可能存在一定的风险，干扰效果会有一定的差异。建议构建好shRNA质粒载体后进行干扰效果的验证工作。

参考文献
1.Paul CP, Good PD Winer l Effectie expression of small interfering R NA in human cells. Nature Biotechnology2002,20(5):505-508.
2.Ladunga I. More complete gene silencing by fewer siR NAs: transparent optimized design and biophysical signatuse. Nucleic Res 2007,35(2):433-440.