钙蛋白酶活性检测试剂盒

钙蛋白酶活性检测试剂盒

Caplain Activity（HY-50112）KIT

一、试剂盒简介

钙蛋白酶的活化参与许多生理学和病理学的过程（比如细胞凋亡）。其活化与质膜和钙离子有关，被活化的钙蛋白酶会释放到细胞质中。钙蛋白酶活性分析试剂盒最大特点是提供的抽提液：只提取细胞质蛋白，而不会影响细胞膜和溶酶体酶；还能防止提取过程中的钙蛋白酶的自活化。因此，该钙蛋白酶活性试剂盒只检测经诱导物（比如化学试剂或者药物）处理过的细胞的胞内活化钙蛋白酶。利用荧光检测的方法, 通过检测钙蛋白酶底物Ac-LLY-AFC的酶切降解而实现。Ac-LLY-AFC能发射蓝光（λmax = 400 nm），而被酶切后生成的自由AFC则释放出黄绿光荧光(λmax = 505 nm)，这种荧光可以用荧光计或者荧光分析仪读取数据。对比处理的样品和正常对照组的样品发射的荧光强度，就可以得出钙蛋白酶活性的改变。

二、钙蛋白酶活性检测试剂盒试剂盒组成

试剂一：抽提液：25ml 1瓶

试剂二：10X工作液：2ml 1瓶，用时用9倍蒸馏水稀释。

试剂三：钙蛋白酶底物 Ac-LLY-AFC： 1ml 1瓶

试剂四：活性钙蛋白酶 I（阳性对照）： 0.2ml 1瓶

试剂五：钙蛋白酶抑制剂 Z-LLY-FMK： 0.2ml 1瓶

试剂六：细胞裂解液 20ml 1瓶

样本前处理：取200-500毫克组织，放入20mmol/L Tris-HCL缓冲液 0.5ml（缓冲液内含5mmol/L β-巯基乙醇, 0.1mmol/L EDTA, 10 mmol/L DTT, 5mmol/L lysocephalin） 在冰浴上匀浆。1000Xg 离心10分钟（4℃），取上清待测。

三、钙蛋白酶试剂盒操作步骤

1、取标本上清液200微升加入试剂一0.2ml，用振荡器充分混合，

2、将混合后的上清液中细胞放置显微镜计数板下进行细胞计数，调节细胞数，样本200微升（含细胞数约为1-2 ×10⁶ 个）。充分混匀，在冰上孵育20分钟

3、用离心机（1000 Xg）离心1分钟，将上清液一部分进行蛋白定量。

4、步骤2处理后的标本分2管，各取100微升，分别加入细胞裂解液100微升、85微升抽提液。然后其中一管加入2微升试剂四活性钙蛋白酶，作为阳性对照，另一管加入2微升试剂五钙蛋白酶抑制剂作为阴性对照

6、在每个测试管中分别加入10微升试剂二工作液和5微升试剂三钙蛋白酶底物

7、37℃，避光，孵育1小时

8、将样本移到96孔板。调机器激发波长400nm发射波长505nm读取样本的荧光值。

9、比较阳性阴性样本检测结果：阳性RFU-阴性RFU为钙蛋白酶活性。活性用样本荧光强度（RFU）/毫克蛋白表示。

四、钙蛋白酶活性检测试剂盒注意事项

储存和稳定性

试剂盒保存温度为-70℃（抽提液和10X工作液开盖后4℃保存）

所有试剂在正确条件下储存，有效期6个月。

参考文献：①见BioVision说明书

②Gheisari,H.R.;Shekarforoush,S.S.and Aminlari,M. Comparative studies

on calpain activity of different muscles of cattle,camel,sheep and goat Iranian Journal of Veterinary Research,University of Shiraz, Vol.8,No.3,Ser.No.20,2007,225-228