从土壤样本中提取DNA

从土壤样本中提取DNA 日本基因株式会社 津田顺
前言
大部分（99.5~99.9%）存在于 土壤中的微生物都不能够在实验室 中进行培养，因此被称为“难培养 型微生物”1)。
采用以前的离析、培养方法， 只可以分析其中少于1%的微生物。 使用从土 壤 中直接提取的 DNA（以下简称土壤DNA）是分析 难培养型微生物的有效方法。这种 方法不仅可用于分析难培养型微生 物，而且还可以用于特定微生物、 重组体等的检测、系统学多样性及
微生物生态分析等领域。2)
土壤DNA的提取及精制 土壤的成份包括矿物质、粘土 等无机物、植物及植物的遗体、腐殖物质等土壤有机物以及在土壤中 生存的微生物。因此，从土壤中直接提取DNA时，会将这些腐殖物质一起提取。这些腐殖物质会阻碍聚合酶链 式反应（PCR）及限制酶处理等酶反 应，从而会影响转录效率，降低DNA 杂交的特异性。因而进行土壤DNA的分子生物 学分析，需要极高纯度的精制DNA。 然而，去除腐殖物质非常困难。如果 采用以前的方法，则需要对提取的土 壤DNA进行凝胶过滤、琼脂糖凝胶电 泳等极为复杂的操作。
日本基因公司生产的土壤DNA 提取试剂ISOIL以及ISOIL for Beads Beating （以下统称ISOIL系列）根据 东京大学的赖泰树博士等开发出来 的新DNA提取法及精制法研制而成。 使用 这些试剂在 特殊条件下 进行 DNA沉淀，基本上可以完全除去腐殖 物质。采用这种方法得到的土壤DNA 具有腐殖物质污染少（图1）、高纯 度（图2）的特点，因此可以直接用 于PCR等酶反应。

日本的土壤DNA提取现状
当前，关于土壤DNA的提取， 研究者们提出了各种不同的方法，而一些国外的公司也开始在日本市场出 售土壤DNA提取试剂。13788987962
但是，由于日本的土壤包括较多的 火山灰土壤，因此使用这些方法或试剂 往往不能够从土壤中提取DNA。3)
火山灰土壤中所包含的粘土矿物 质水铝英石对 DNA 有极强的吸附作 用。黑土（约占日本耕地面积的一半） 即是一种含有水铝英石的火山灰土壤。 为了从此类土壤中提取DNA，必须采 取某种方法来减少土壤对DNA的吸附 作用。ISOIL系列产品利用特殊成份的提 取液，可防止土壤对DNA的吸附作用。
因此，这些产品对非火山灰土壤的 DNA提取效果自然无须赘言，即使是 对 火 山 灰土壤 ,也可以得到很好的DAN提取效果（图3）。

土壤提取DNA可以反映土壤微生物的生态
为了进行基于PCR-DGGE（变性剂浓度梯度凝胶电泳）的土壤微生物群落 结构分析以及微生物生态研究，必须得 到 可 以 反映实 际微 生物生 态的 土 壤 DNA。
但是，由于土壤中生存着大量的革 兰阳性菌（如链霉菌）、丝状菌（霉菌） 等具有坚固细胞壁的微生物，因此使用 一般的方法难以有效地提取这些微生 物中的DNA。
为了从上述微生物中提取DNA，比较有效的做法是联合采用 化学溶菌方法及物理法（如 ISOIL for Beads Beating）。 使用这样方法提取的土壤 DNA由于物理作用会被部分切断，变成较 低分子 的 DNA （ ~23kb ） 。由于 PCR-DGGE的 PCR 模板，因此上述低分子 DNA完全可以用于 PCR-DGGE 分析（图4）。

在基因资源方面的应用
环境中的微生物整体提取出 来的DNA被称为“宏基因组”。由 宏基因组构成的宏基因组库被认为是新基因的的信息来源,作为基因资源的土壤 DNA 必 须是高分子DNA。
使用 ISOIL 及界 面活 性剂的加 热 提取法虽然会降低具有坚固细胞壁的 微生物的溶菌效率，但是DNA的提取 条件极为稳定，因此可以得到平均分子 量50kb以上的高分子土壤DNA（图5）。

本公司进行的使用 ISOIL 系列 产品的土壤DNA提取实验中，我们采 用了从日本东北部到九州的各种土壤， 甚至于有明海的潮浸区及活性淤泥，结果都得到相应的DNA提取物。 但是，考虑到土壤样本的多样性、土壤的种类及状态，有时可能会出现提取量不足或纯度不高的现象。在这种情 况下，则需要考虑土壤的特殊性质。然而，我们始终认为ISOIL系列是 日本的土壤微生物学研究的基础技术， 在将来也会得到进一步的开发。

〔参考文献〕
１） Torsvik, V., Goksoyr, J. and Daae, F. L.:
Appl. Environ. Microbiol., 56, 782-787 (1990).
２） Zhou, J.-Z., Bruns, M. A. and Tiedje, J. M.:
Appl. Environ. Microbiol., 62, 316-322（1996）.
３） Takada-Hoshino, Y. and Matsumoto, N.:
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４） Rondon, M. R., August, P. R., Bettermann,
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编号 品名 容量 资料索取 021-50272976，77，78 转6221杨树彦 13788987962

316-06211 ISOIL 50次用

319-06201 ISOIL for Beads Beating 50次用

313-06221 Lysis Solution BB SP1 50毫升
Lysis Solution BB SP1是ISOIL for Beads Beating专用的可选产品，可用于富含水铝英石的土壤的DNA提取。
※ 东京大学TLO已经申请了使用ISOIL及ISOIL for Beads Beating的土壤DNA提取法的专利。日本基因公司从东京 大学TLO得到了关于使用土壤DNA提取方法的许可。