O~6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的检测说明书

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供应商 ： 上海信裕

检测方法 ： 见说明

O~6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的检测 说明书

~6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(O~6-alkylguanine-DNA alkyltransferase，AGT)是DNA中O~6-烷基鸟嘌呤的主要修复蛋白，它能将烷化D N A 分子上的O 6- AGT的甲基转移到自己身上, 使受损伤的碱基得到修复, 而酶自身失去活性。本方法的原理就是通过测量转移到0 6 一AGT 上3H –烷基的放射性来反映酶的活性。

O~6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的检测说明书标本的收集：采用密度梯度离心法提取人外周血淋巴细胞。使用Hank’s液将血样1：1稀释从冰箱中取出4℃避光保存的淋巴细胞分离液。摇匀后在无菌状态下加入刻度离心管中，将盛有分离液的离心管放入37℃水浴中平衡。用吸管将稀释的血液沿离心管壁徐徐加到分离液面上，用力要轻，避免血液冲入分离液中，使得稀释血重叠在分离液面以上，拧紧管盖。稀释血与分离液的高度比在1：2，将离心管放置于水平离心机中，室温下 2000rpm离心20min。离心结束后可见管内分为四层，从上至下分别为：血浆层（含部分血小板）、白膜层（含单个核细胞及少量血小板）、分离液层、粒细胞及红细胞层。将吸管轻轻穿过血浆层至白膜层，沿离心管周缘吸出血浆层与分离液层界面间的白膜层细胞，置于新离心管中。加吸出体积5倍以上的Hank’s液体，用吸管吹打均匀，避免产生气泡，液拄高度不要超过离心管的2/3。室温1500rpm离心10min，快速倾倒出上清液。用Hank’s重悬细胞，注意吹打均匀。室温下1500rpm离心5min，洗涤两次。沉淀用1毫升PB缓冲液稀释，放入离心管，超声30秒，取出混均，再进行超声30秒。加入PMSP(8.7毫克/毫升 乙醇中)，4度16000RPM离心20分钟，上清液待测。
上清液一部分测蛋白定量，另一部分测O~6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性。

O~6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的检测说明书标记物的制备:20克小牛胸腺DNA物质溶解于5毫升PH7.2 0.2M/L的二甲钠，1Mm/L EDTA,加入1mCi的3H-methylnitrosourgamethylated 37度2小时。加入12毫升冷乙醇-20度过夜，取出然后于0℃ 50O0r/min 离心3 0 min,弃上清。
沉淀加5 ml TE 缓冲液(10 m M/L TRIS lm M/L EDTA , pH 8.0)溶解, 再加入12ml 冷无水乙醇-20℃过夜在0℃ 5000r/m in 离心30min.弃上清。
沉淀加入5ml TE 缓冲液, 混匀, 于80 ℃水浴l6h. 室温放置1.5h , 在4 ℃ 用TRIS EDTA 缓冲液透析24h(10 m M/L Tris , 1M/L NaCL, 1m M /L EDTA , p H 8.0)。再用TE 缓冲液透析一天,上午、中午、下午各更换一次透析液, 透析后3H-methylnitrosourgamethylated 一D N A 分装,-2 0 ℃ 保存备用.
二甲苯闪烁液：0.02%P0P0P 0.4%PPO于500毫升的二甲苯。
缓冲液：50mM Tris-HCL, 3nM二硫苏糖醇 ,1mM EDTA, 8.7mg/ml PMSF. 500ml.

O~6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的检测操作步骤
测量管 对照管
标本 100 ---
缓冲液 --- 100
标记物 100 100
37度 120分钟
BSA 100 100
高氯酸(4M) 100 100
混均
高氯酸（1M） 200 200
75度 40分钟 12000转/分 20分钟去上清
高氯酸(1M) 400 400
混均

NAOH(0.01M) 100 100
混均
闪烁液 3000 3000
混均，测量.

按下面公式计算出O~6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性

酶活性(fmol/mg prot)=(样品放射性计数值—对照管放射性计数值）/同位素比活性*45
。
范围：135-330 fmol /mg
xyB837Bo 【中文名称】：牛白介素2受体α(IL2Rα)ELISA试剂盒 【英文名称】：ELISA Kit for Interleukin 2 Receptor Alpha (IL2Ra) 【灵敏度】：9.375pg/mL
xyA563Bo 【中文名称】：牛白介素1β(IL1β)ELISA试剂盒 【英文名称】：ELISA Kit for Interleukin 1 Beta (IL1b) 【灵敏度】：9.375pg/mL
xyA540Ge 【中文名称】：皮质酮(CORT)ELISA试剂盒 【英文名称】：ELISA Kit for Corticosterone (CORT) 【灵敏度】：9.375pg/mL
xyC918Po 【中文名称】：猪成纤维细胞生长因子21(FGF21)ELISA试剂盒 【英文名称】：ELISA Kit for Fibroblast Growth Factor 21 (FGF21) 【灵敏度】：9.375pg/mL
xyA005Bo 【中文名称】：牛血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ)ELISA试剂盒 【英文名称】：ELISA Kit for Angiotensin II (AngII) 【灵敏度】：9.375pg/mL
xyA552Eq 【中文名称】：马组织金属蛋白酶抑制因子1(TIMP1)ELISA试剂盒 【英文名称】：ELISA Kit for Tissue Inhibitors Of Metalloproteinase 1 (TIMP1) 【灵敏度】：9.375pg/mL
xyA623Mu 【中文名称】：小鼠谷胱甘肽S转移酶ω1(GSTω1)ELISA试剂盒 【英文名称】：ELISA Kit for Glutathione S Transferase Omega 1 (GSTo1) 【灵敏度】：9.375pg/mL
xyC023Ca 【中文名称】：狗葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)ELISA试剂盒 【英文名称】：ELISA Kit for Glucose Transporter 4 (GLUT4) 【灵敏度】：9.375pg/mL
xyA886Bo 【中文名称】：牛过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)ELISA试剂盒 【英文名称】：ELISA Kit for Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma (PPARg) 【灵敏度】：9.375pg/mL
xyA008Ca 【中文名称】：狗血管生成素1(ANGPT1)ELISA试剂盒 【英文名称】：ELISA Kit for Angiopoietin 1 (ANGPT1) 【灵敏度】：9.375pg/mL
xyA393Gu 【中文名称】：豚鼠P物质(SP)ELISA试剂盒 【英文名称】：ELISA Kit for Substance P (SP) 【灵敏度】：9.375pg/mL
xyA462Ge 【中文名称】：皮质醇(Cor)ELISA试剂盒 【英文名称】：ELISA Kit for Cortisol (Cor) 【灵敏度】：9.375pg/mL
xyA899Po 【中文名称】：猪骨桥素(OPN)ELISA试剂盒 【英文名称】：ELISA Kit for Osteopontin (OPN) 【灵敏度】：9.375pg/mL