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文献和实验
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原位杂交
一、实验原理：
原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件：组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)、有与探针结合的标记物。
二、议器设备
1、冰箱 海尔BCD-256KFD 青岛
2、隔水式恒温孵育箱 GNP-9080 上海精宏实验设备有限公司
3、切片机 LEICA RM2145 德国LEICA公司
4、展片机 Leica HI1210 德国LEICA公司
5、烤片机 Leica HI1220 德国LEICA公司
6.、水浴锅
7、杂交炉 Biometra Compact Lin OV04
三、探针的设计以及优化：
兴拓生物采用的Exiqon 公司生产的MiRCURYTM 原位杂交检测探针具有高度的亲和活性和高超的碱基错配识别能力，无论是组织切片、细胞，或是经过甲醛固定、石蜡包埋的标本，都能精确检测其中的miRNAs。LNA是高亲和力的核酸拟似物，它能够显著提高DNA寡核苷酸的杂交效率。Exiqon合成的原位杂交检测探针运用了掺入LNA的设计（约掺入30%LNA），每融合一个LNA能够使DNA/RNA杂交的Tm值升高2-10度。Tm值的升高能增强LNA-DNA/RNA双链的稳定性，使即使20nt的短探针也能拥有较高的Tm值（70度以上），以满足严格杂交条件下的原位杂交实验。
MiRCURYTM 原位杂交检测探针主要优点：
高灵敏度，可以检测普通oligo探针检测不到的微量miRNAs。
覆盖所有已知的miRNAs。
高特异性，能够区分单碱基或2个碱基差异的miRNAs。
适应多种标记方法，如DIG、生物素、荧光。
提供完整的实验步骤。
四、实验步骤：
NOTE: All incubations were carried out at room temperature on a nutator(
DAY 1:
1、样本的准备，组织的包埋；切片；
2、固定；
3、破膜；
4、甲醇脱水；
5、漂白过夜。
DAY 2:
1、探针的水化；
2、预杂交；
3、DIG标记的探针进行原位杂交，缓慢晃动16h；
DAY 3:
1、柠檬酸缓冲液梯度冲洗；
2、MABT缓冲液冲洗；
3、封闭；
4、一抗的孵育（Labeled with anti-DIG antibody (1:2000, Roche) in blocking solution），4°过夜；
DAY 4:
1、MABT缓冲液清洗样本；
2、BCIP/NBT室温避光显色20min；
3、PBST清洗；
4、后固定4°过夜。
DAY 5:
拍照分析
五、客户研究实例
