引用本文
黄婧洁, 李苗, 陈莹娴, 钟雅兰, 张婷婷, 姜廷超男, 李建成. 基于免疫磁珠净化间接竞争酶联免疫吸附试验检测氟喹诺酮类药物[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(2): 766-778.
HUANG Jingjie, LI Miao, CHEN Yingxian, ZHONG Yalan, ZHANG Tingting, JIANG Tingchaonan, LI Jiancheng. Indirect Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Detection of Fluorquinolones based on Immunomagnetic Bead Purification[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2023, 54(2): 766-778.
基于免疫磁珠净化间接竞争酶联免疫吸附试验检测氟喹诺酮类药物
黄婧洁1,2, 李苗1,2, 陈莹娴1,2, 钟雅兰2, 张婷婷2, 姜廷超男2, 李建成1,2
摘要：本研究旨在建立一种基于免疫磁珠进行分离、富集和净化前处理，检测鸡肉、鸡肝和鱼肉中氟喹诺酮类药物残留的间接竞争酶免疫吸附试验（indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay，icELISA）的研究方法。通过对合成免疫磁珠及免疫磁珠净化过程中单克隆抗体添加量、偶联时间、缓冲液pH、抗原添加量、抗原捕获时间、温度及包被条件等进行优化，初步建立了基于免疫磁珠净化的icELISA检测方法。结果显示：1）在1 mg的磁珠中，沙拉沙星（sarafloxacin，SAR）单克隆抗体最佳偶联量为15 μg，偶联时间60 min，pH为4.4；2）最佳抗原添加量为1 ng·mL-1，捕获时间40 min，缓冲液为0.01 mol·L-1 PBS，IC50为0.73 ng·mL-1，线性范围为1.0~3.2 ng·mL-1；3）氟喹诺酮类药物在鸡肉、鸡肝、鱼肉的检测限均不超过1.33、2.17、2.31 μg·kg-1，回收率为76.83%~98.70%，批内变异系数批间变异系数均不超过15%，经验证，鸡肉样本检测结果与高效液相色谱法（HPLC）结果一致。结果表明，与传统仪器检测方法相比，该方法提高了检测氟喹诺酮类药物的简便性、选择性以及检测效率，为氟喹诺酮类药物的残留检测提供了新思路。
关键词：免疫磁珠富集 氟喹诺酮类药物 单克隆抗体 间接竞争酶联免疫吸附试验(icELISA)
Indirect Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Detection of Fluorquinolones based on Immunomagnetic Bead Purification
HUANG Jingjie1,2, LI Miao1,2, CHEN Yingxian1,2, ZHONG Yalan2, ZHANG Tingting2, JIANG Tingchaonan2, LI Jiancheng1,2
Abstract: The aim of this study was to detect fluoroquinolones (FQs), in chicken, chicken liver, and fish, an indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (icELISA) was developed based on immunomagnetic beads for sample clean-up and purification. (Method) Optimizing the addition amount of monoclonal antibody, coupling time, pH of buffer solution, the addition amount of quinolone antigen, capture time of antigen, temperature, and encapsulation condition of immunomagnetic beads, an icELISA method based on immunomagnetic beads clean-up was preliminarily established. Results were as follows: 1) In 1 mg magnetic beads, the optimal coupling amount of sarafloxacin (SAR) monoclonal antibody was 15 μg, coupling time was 60 min, pH was 4.4; 2) The optimal antigen dosage was 1 ng·mL-1, capture time was 40 min, and the buffer ion concentration was 0.01 mol·L-1 PBS. The IC50 was 0.73 ng·mL-1 with a linear range of 1.0-3.2 ng·mL-1; 3) The detection limits of fluoroquinolones in chicken, chicken liver and fish were less than 1.33, 2.17 and 2.31 μg·kg-1, and the recoveries ranged from 76.83%-98.70% with intraday and interday variation coefficients lower than 15%. The recovery results were further confirmed using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The results suggest that, compared with the traditional instrumental detection method, this method can improve the simplicity, selectivity, and detection efficiency of fluoroquinolones, and provide a new idea for fluoroquinolones residue detection.
Key words: enrichment of immunomagnetic beads quinolones monoclonal antibody indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (icELISA)
氟喹诺酮类药物(fluoroquinolones, FQs)为人工合成的抗菌药，它能抑制细菌DNA螺旋酶[1]，干扰DNA合成，具有抗菌谱广、高效、低毒等特点，广泛用于畜牧和水产养殖[2-4]。沙拉沙星是喹诺酮类化合物第三代产品——氟喹诺酮类药物的一种，是第一个被美国批准用于食品动物的氟喹诺酮类药物，有报道表明沙拉沙星(sarafloxacin, SAR)在体内分布极为广泛，组织穿透力强具有较强的抗菌活性，可用于全身及深部组织感染的治疗[5]，因此在国内外应用较为广泛。可以作为氟喹诺酮类药物的代表药物进行研究，但该类药物有潜在的致癌性和遗传毒性，诱发低血糖[6]，并进一步危害人类的身体健康[7]，因此其残留监控和检测必不可少。目前，氟喹诺酮药物常用的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)[8-10]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[11-13]、酶联免疫法(ELISA)[14]、毛细管电泳法(CE)[15]、胶体金免疫层析技术(GICA)、化学发光法(CL)[16-17]、比色法[18]等。与其他方法相比，免疫法具有操作简单、价格低廉的优点，可以实现氟喹诺酮类药物的快速检测。
免疫磁珠(immunomagnetic beads, IMB)是发展起来的一项新的免疫学技术，是运用核-壳的合成方法合成含有超顺磁性物质的高分子表面覆盖的复合材料，其稳定性好、能进行后期标记，利用这些物质表面的功能基团如氨基、羧基、巯基等进行抗体的共价或者非共价偶联[19-21]，可用于结合相应的抗原或抗体，在外加磁场下做定向移动，从而达到分离，检测的目的[22-24]。童丽[25]运用免疫磁珠结合化学发光法，实现了赭曲霉毒素a的快速检测。免疫磁珠最近也被证明是能检测人类肿瘤的标志物，具有高灵敏度的优点[26-28]。Olejnik等[29]和Tian等[30]对免疫磁珠净化和SPE前处理进行比较，结果显示，免疫磁珠清除法有较高的准确性和特异性，且材料可以重复使用。与传统的亲水亲油平衡柱净化法相比，该方法的抑制效率和灵敏度均有所提高，此外免疫磁珠净化法简便快速、重复性好，满足国内外残留检测的要求，在实际应用中具有良好的前景，为复杂基质中药物残留的分析提供了一种新方法，新思路。
本研究建立了一种高效、简便的基于免疫磁珠净化的间接竞争酶联免疫吸附试验(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay, icELISA)检测鸡肉、鸡肝和鱼肉中氟喹诺酮类药物的检测方法。将代表药物沙拉沙星单克隆抗体固定在直径为2.8 μm的羧基化磁珠表面。简单提取后，药物被免疫磁珠特异性吸附，上清液被磁选去除。在icELISA之前，通过甲醇洗脱释放保留在磁珠上的分析物，分别对免疫磁珠制备、免疫磁珠净化和icELISA条件进行了优化，该法准确可靠，方便快速，灵敏高效，可满足11种氟喹诺酮类药物残留检测的要求，在实际应用中具有良好的前景。
1.2 主要仪器与设备
Multiskan FC酶联免疫测定仪：美国Thermo公司；Quattro LC超高效液相色谱仪串联质谱仪：美国Waters公司；Mag-12-1磁分离架：深圳市博尔熙科技发展有限公司；BE-1200z旋转混合仪：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；Primo R台式高速冷冻离心机：德国贺力氏台式高速冷冻离心机；PHSJ-3F pH检测仪：上海雷磁仪器有限公司；WH-I型微型漩涡混合仪：上海仪电分析仪器有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：巩义市予华仪器有限责任公司；RP508恒温摇床：上海仪电分析仪器有限公司。
