Biocoat HTS Caco-2检测系统

库存 ：大量

供应商 ：广东合华科技有限公司

保存条件 ：-20度储存

操作指南
Caco-2细胞来源于人结肠癌细胞，能在培养过程中进行肠细胞的分化，其单层细胞常做研究小肠上皮细胞的物质转运和代谢的体外模型。BD BioCoatTM HTS Caco-2系统由BioCoat肠上皮细胞生长环境和Falcon 24孔板培养小室组成，每个kit包括特别配方的无血清培养基、添加剂、接种培养基、纤维胶原包被的HTS 24孔插入小室。

具体操作步骤如下：
1、配制MITO+血清添加剂和培养基
1.1用70%乙醇对MITO+血清添加剂试剂瓶擦拭消毒后，加入500μL细胞接种基础培养基溶解冻干粉末。
1.2将250μL溶解后的MITO+加入到基础接种培养基的容器瓶中。
1.3将另外250μLMITO血清培养基加入到Entero-STIM™培养基中。
1.4所有培养基应存放于原始包装瓶中，2-8℃储存，保质期 21天。

2、细胞的接种和生长
2.1 用胰酶/EDTA消化培养瓶中的Caco-2细胞。建议细胞达到250，000 cells/cm2以上的浓度后进行消化收集。消化后，去除或中和胰酶/EDTA，细胞重悬于37℃预热的已添加MITO+血清混合物的基本接种培养基中，调整细胞浓度到4×105cells/mL。
2.2在各小室中加入500μL细胞悬液。（接种浓度为每个小室200,000cells或6.6×105cells/cm2）。
2.3在多孔饲养板（Mutilwell™ Feeder Tray）中加入35mL 37℃预热的含MITO+血清混合液的基础培养基。
2.4 在37,5%CO℃2，100%湿度条件下孵育20-24小时。

3.、细胞的分化——加入Entero-STIM™培养基，
3.1 小心去除小室底部和小室上部的基础培养基。
注意：过多的抽吸会破坏细胞单层和纤维胶原蛋白包被层，引起错误的渗透性计算结果。
3.2在每个小室中加入37℃预热的500μL 含MITO+血清混合物的Entero-STIM培养基。然后在多孔饲养板中加入35mL 37℃预热的含MITO+血清混合液的Entero-STIM培养基。
3.3 在37,5%CO℃2，100%湿度条件下孵育44-48小时.已经通过甘露醇扩散证明Caco-2在时间范围内分化。

4、渗透性实验推荐方法
注意：该实验部分无需在无菌环境下操作。
渗透性研究中，生长于Caco-2系统上的细胞单层需要放置在Falcon24孔板中用于化合物的渗透性过程研究。
尽管盖子和饲养板没有方向，但是为了避免各孔间污染，孔板设定为一个统一的方向。为了与培养小室匹配，确保Falcon的商标均在2者上方，面向同一个方向。
4.1 上/下小室渗透性实验
4.1.1将细胞培养小室从进料板中取出，直接放入Falcon24孔板中。（该24板需要另行购买）
4.1.2 小心去除各小室中Entero-STIM™培养基。可用适合的转运缓冲液清洗。
4.1.3在各小室内加入300μL溶解于缓冲液的待测样品。（可选体积范围见表1）
4.1.4在Falcon 24孔板各孔中加入1000μL转运缓冲液。（可选体积范围见表1）


注意：超过500μL的缓冲液会引起测试样品溢出小室。
4.1.5 在适合的温度下孵育，并轻微摇动（通常为50rpm）。实验温度，孵育时间，摇动参数，应根据每个不同的实验自行确定。
4.1.6 从各个进样口去除溶液，测定待测样品在下小室中的浓度。进样口与200μL和1000μL枪头匹配。可采用液相闪烁计数法计算。
4.2 下/上小室渗透性研究
4.2.1将细胞培养小室从进料板中取出，直接放入Falcon24孔板中。（该24板需要另行购买）可用适合的转运缓冲液清洗。
4.12.2 小心去除各小室中Entero-STIM培养基。可用适合的转运缓冲液清洗。
4.2.3在各小室内加入300μL缓冲液。（可选体积范围见表1）
4.2.4在Falcon24孔板各孔中加入1000μL溶有待测样品的转运缓冲液。（可选体积范围见表1）
4.2.5在适合的温度下孵育，并轻微摇动（通常为50rpm）。实验温度，孵育时间，摇动参数，应根据每个不同的实验自行确定。
4.2.6从各个进样口去除溶液，测定待测样品在上小室中的浓度。进样口与200μL和1000μL枪头匹配。

5.、常用结果
a．细胞接种后24小时可见汇合的细胞单层。
b．甘露醇渗透性测定可在加入添加了混合剂的Entero-STIM培养基48小时后进行。室温时，当用PBS作为转运缓冲液时，甘露醇的典型渗透约为4×106cm/sec。（有效生长面积为0.31cm2）

6、可选方法
注意：所有方法的修改必须预先经过验证。
6.1 延长细胞生长期，以配合实验进度
一旦添加了含MITO+血清添加剂的Entero-STIM培养基，分化就会开始，细胞单层就会在24-48小时后形成，在此之后，细胞单层会逐渐渗漏。
如果想要修改3天的Caco-2实验方法，细胞单层生长的相关步骤需要调整。
步骤2.2（细胞生长）中的20-24小时时间范围不是该步骤中的关键因素。细胞可以在培养基内生长3天，直至培养基耗尽（pH值改变）。因此，可以再周五下午接种，周一上午替换为Entero-STIM培养基，周三（48小时后）形成细胞单层。有时候，3天内培养基用量不够，需要更换。
6.2 更长的分化细胞单层
如果需要更耐时的细胞单层，以下方法可以采用。用基础接种培养基（355257）以1：10稀释Entero-STIM，将该溶液用于细胞分化（但仍需添加MITO-血清混合剂）。细胞单层的耐时性延长了，但是缺点是一些分化的标记物和具备转运功能的酶活性不能上调或不能表达。