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文献和实验
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服务名称 ：DNA文库构建及EST测序
提供商 ：生工生物工程
DNA文库构建及EST测序
4-1 cDNA文库构建
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生工基于Clontech的SMART方法和独具的技术优势及严格的质量控制，确保客户得到满意的 cDNA文库，可以使您获得最多的全长基因，全长率最高可达90%；结合完整的实验室构架，无缝对接3730XL测序平台可同时进行EST测序，使您更有 效地节省时间，提高效率。
十年多来，生工先后对线虫、真菌、白色念珠菌、盐藻、华支睾吸虫、油菜、水稻、棉花、大鼠、小鼠、人等数十个物种进行cDNA文库构建和Unigene测序，先后测定了数百万个序列，拥有丰富的均质化文库构建经验。
实验流程见右图：
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4-2 EST测序
| ESTs即表达序列标签（expressedsequence tags, ESTs），短的、单次（测序）阅读的cDNA序列，也包括来自于差异显示和RACE实验的cDNA序列。对构建好的文库进行测序，同时可以获得ESTs信息分析服务。
W4-2-1 EST测序的应用
1.基因的表达谱分析；
2.从EST中可以发掘SSR标记；
3. EST可以作为构建分子标记连锁图谱所用的探针。
W4-2-1EST服务内容ESTs信息分析服务又分为基本信息分析服务和高级信息分析服务。
具体分析流程见右图。
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1.基本信息分析服务
（1）从峰图到序列的转化，去除低质量的序列和载体序列；
（2）序列拼接；
（3）EST注释；
（4）ORF预测及分析；
（5）利用 nr和nt数据库进行注释。
2.高级信息分析4-3 服务报价及服务须知
（1）代谢途径分析；
（2）功能蛋白分析；
（3）Interpro功能域分析；
（4）序列属性及其对应unigene分析；
（5）COG分析。
4-3 服务报价及服务须知
| 项 目 | 内 容 | 价 格 |
| Smart cDNA文库 | cDNA文库构建 | 15,000.00元（赠20个测序） |
| 均一化cDNA文库 | 全长cDNA文库构建 | 25,000.00元（赠50个测序） |
| EST测序 | <5,000条 | 25.00元 |
| 5,000-10,000条 | 22.00元 | |
| >10,000条 | 询价 | |
| 基础信息服务 | 免费 | |
| 高级信息服务 | 询价 | |
| 送样要求 | 提供保质保量的组织（5 g）、细胞株（2×107细胞）、总RNA>20 μg | |
| 实验周期 | 4~6周 | |
4-4 实验内容及提供结果
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实验内容
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提供的结果及材料 |
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第一阶段
1. 提取总RNA，分离、纯化总mRNA后，进行反转录合成cDNA第一链。
2. 通过引物延伸或LD-PCR法进行dscDNA合成，经SfiI酶切后，经层析柱分离cDNA（回收大于500 bp的cDNA）。
3. 将分级纯化的dscDNA与SfiI酶切的逆转录病毒载体（Amp抗性）连接。
4. 将重组产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞。
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1. 高质量的起始RNA变性电泳图。
2. dscDNA电泳图和 的SfiI酶切图。
3. 转化大肠杆菌生长的重组克隆（即原始库）培养皿照片。
4. 详细的研究结果和分析。
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第二阶段
1. 甘油保存大肠杆菌文库。
2. 初级cDNA文库的QC。
（1）不同稀释度测定平均滴度，检测库容量（重组子克隆数目）。
（2）随机挑取40个克隆子，PCR方法或SfiI酶切检测重组克隆子比例（重组率），检测平均插入片段大小。
（3）每个文库随机挑取20个克隆子抽提质粒进行双向测序，通过序列分析判断插入片段是否含有全长ORF。
3. 文库验收标准：
库容量： >1×107 cfu/ml 平均插入片段： >1.2 kb 重组率：>95% 全长基因比例：>65%
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1. 不同稀释度生长的重组克隆培养皿照片和平均滴度计算过程 。
2. 构建好的初始cDNA文库的菌液（含甘油）5 ml，分装0.5 ml/管（冻存-80°C）。
3. 40个克隆子的PCR鉴定电泳图（含marker标注）和插入片段长度数据。
4. 20个随机克隆子的双向测序报告纸制版（含测序引物序列和所在载体位置）和分析 。
5. 文库的评价，包括库容量、插入片段平均长度、重组效率、cDNA 完整性评价。
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生工生物工程（上海）股份有限公司
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