普通RT-PCR

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服务名称：普通RT-PCR

提供商：凯基生物

普通RT-PCR

实验目的：目的基因表达的相对定量。
实验原理：利用反转录酶，把mRNA反转录生成 cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，即RT-PCR，RT-PCR对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。
实验仪器：Eppendorf Centrifuge5804R、UV-visible Spectrophotometer、BIO-RAD Gel DocTM XR、Multitene TC9600-G-230V LabNet。
实验内容与方法：
1. 查找基因序列或相关参考文献，设计或查找特异性的引物，并化学合成引物；
2. 提取样品总RNA，分光光度法测定总RNA含量，电泳鉴定总RNA完整性；
3. 根据基因属性进行反转录，得到cDNA模板；
4. 使用1中合成的引物进行PCR预实验与正式实验；
5. 结果分析，提交实验报告。
实验信息（客户提供）：
1. 基因信息：
待测样品种属：
基因全称与ID：
备注说明：
2. 实验材料：
（1）样本材料；
（2）试剂材料。
服务周期：2周至8周（具体视样品数而定）。
结果提交：提交实验报告书（包括实验材料、试剂、仪器、实验过程方法、结果及分析）、原始数据、图片，文本或电子版。
实验范例：RT-PCR法检测基因1/基因2基因的表达
1. 引物设计与合成
内参 primer (527bp):
F: 5’-CTACAATGAGCTGCGTGTGG-3’
R: 5’ -CGTGAGAAGGTCGGAAGGAA -3’
基因1 primer (320bp):
F:5’ -CTGAAGAGCGTGAAGGTTGGA-3’
R:5’ -AAGGATGTGGAGGGAGATGAGT-3’
基因2 primer(600bp):
F:5’- AAATTAATCATATGTGCAGCTGCTCCCCGGTGCAC-3’
R:5’ -GCTTAYGGGTCCTCGATGTC-3’
2. RNA提取与质量检测
RNA的浓度＝OD260×稀释倍数×0.04μg/μL，OD260/280 在1.8～2.1视为抽提的RNA的纯度很高；总RNA琼脂糖凝胶电泳28S、18S、5S三条带较为完整。
3. 基因1/基因2电泳图

4.基因1/基因2灰度分析

编号	标记	内参	基因1	基因2	基因1/内参	基因2/内参
1	A1	22557768	2627551	6075628	0.12	0.27
2	A3	23348405	4866236	9452751	0.21	0.40
3	B1	22999379	18693451	27150413	0.81	1.18
4	B2	21568823	20953103	28658840	0.97	1.33
5	B3	22274703	22318120	30683768	1.00	1.38
6	C1	22201248	14778919	23730492	0.67	1.07
7	C2	25011940	12546797	22167099	0.50	0.89
8	C3	25721050	14983395	25352899	0.58	0.99
9	D1	25629084	7779386	15667176	0.30	0.61
10	D2	25420912	11243874	20425764	0.44	0.80
11	D3	23350696	8354176	16179076	0.36	0.69
12	E1	23118874	4234863	13004029	0.18	0.56
13	E2	23175654	2848642	9611656	0.12	0.41
14	E3	19456448	5556296	11803447	0.29	0.61