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- 【产品名称】
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- 通用植物总RNA提取试剂盒(离心柱型)
- 产品说明:
- 本产品是BioTeke自主开发的独特_产品,其原理完全不同于/酚/氯仿提取方法,克服了后者不能区分RNA (本质上是多糖)和其他植物多糖的缺点,能高效将RNA和其他植物多糖分开,同时还能有效去除多酚和其他植物次级代谢成份,适合于绝大部分用TRIZOL和QIAGEN Rneasy mini kit无法提取的植物,并在近100多种各类植物(包括十分棘手的松柏类植物)中得到验证。本产品还可以用于富含粘性糖蛋白的动物组织。
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- 特点:
- ◆ 适用于绝大多数植物,从一百多种植物材料中都成功提取到了总 RNA,其中包括松针、柏树、香蕉、苹果、龙眼、荔枝、葡萄等用胍/酚/氯仿方法未能提取到 RNA 的植物。
- ◆ 操作简单快速,只需要三十分钟。
- ◆ 特殊的DNA去除方法,一般不需要另外用DNA酶消化。
- ◆ 得到的 RNA 平均 OD260/280 在 1.9 左右,可直接用于 RT-PCR 和Northern 等研究。
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- 应用范围:
- 适合提取的植物包括:苹果、葡萄、草莓、香蕉、龙眼、荔枝、草坪植物(马蹄金、早熟禾、高羊茅),树(紫椴、花楸、榛、海棠花、栓皮栎、白桦、槭槭、山毛榉、云杉、獐子松),观赏植物草和花(紫罗兰、毛爪草、丁香、月季、天竺葵、仙客来、菊、牵牛花)观赏植物叶子(紫松果、彩叶草、一品红、夹竹桃、垂叶榕)等。
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- 试剂盒由裂解液PL,去蛋白液RE,漂洗液RW,RNase-free H2O,70%乙醇, RNase-free Dnase(可选),10x Reaction Buffer(可选),RNase-free过滤柱,RNase-free吸附柱RA,收集管(2mL)使用说明书和合格证组成。主要组分及储存条件见表 1 。
实验所需试剂但未提供的物品: * 无水乙醇 * β-巯基乙醇(防止褐化现象,非富含多酚类植物可不加) * 无RNA酶的水或0.5% SDS溶液[调配无RNA酶的水,将水加入无RNA酶的玻璃瓶中,加入DEPC至0.1% (v/v)。放置过夜并高压灭菌。SDS溶液必须用DEPC处理过并经高压灭菌的水配制。 注:每瓶试剂的净含量应不少于标示值。 【储存条件及有效期】 1、漂洗液RW在2-8℃条件下保存,长期保存-20℃条件下保存;裂解液PL在室温储存 , 长期保存-20℃条件下保存;RNase-free Dnase,10×Reaction Buffer在-20℃条件下保存,其他试剂可常温保存。 2、本试剂盒有效期一年,请在有效期内使用。 3、为了避免试剂长时间暴露于空气中发生挥发、氧化、pH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。 【适用仪器】 本产品可适用于匹配1.5/2.0 mL 离心管的高速冷冻离心机。建议使用升降速较快的离心机,如百泰克CR3180。 【样本要求】 新鲜或保存得当的植物样品。样本采集后尽快实验,可在2~8℃暂时保存;若需长期保存,应置于-80℃环境中。 【使用方法】 事先将裂解液PL 65°C预热,使用前可加入β-巯基乙醇到终浓度0.2%(每1mL裂解液PL加入β-巯基乙醇2μL,防止褐化现象,非富含多酚类植物可不加)。 1.样本处理 取50~100mg植物组织于液氮中研磨,时间要短,要保持研钵中有液氮(如果没有液氮也可以直接加1mL的裂解液PL后匀浆。组织样品容积不能超过PL容积的10%)。 2.转移样品至1.5mL RNase-free离心管中,加入1mL的裂解液PL颠倒混匀,在65°C条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。 3.室温条件下12,000rpm 离心5分钟, 小心取上清转入一个新的RNase-free过滤柱中(若上清表面有漂浮物,用枪头跳开吸取下面液体即可)。 4.10,000rpm 离心45秒。收集下滤液(含有总RNA)到一个新的2mL RNase-free离心管中,进行下一步操作。 5.在2mL RNase-free离心管中加入等体积70%乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇!),颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)。 6.得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中(吸附柱套在收集管内),10,000rpm 离心45秒,弃掉废液,将吸附柱重新套回收集管。(吸附柱RA单次上样量最多700 μL,若样本量大于700 μL需分多次过柱)。 含DNA酶操作步骤 a.加入500μL漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000 rpm 离心60秒,弃掉废液。 b.将吸附柱RA放回空收集管中,12,000 rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制酶消化反应。 c.加入已配置好的消化液30μL于吸附膜的中间部位,37℃保温15-30分钟。消化液的配置比例:RNase-Free DNase 2μL,DNase 10×Reaction Buffer 3μL,RNase-Free Water 25μL;RNase-Free DNase的用量可根据DNA量多少来调节,1μLRNase-Free DNase可以消化1μg的RNA,10×Reaction Buffer的量按照比例增减。 d.加入500μL 去蛋白液RE,室温放置2分钟,12,000rpm 离心45秒,弃掉废液。 e.加入700μL漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇),12,000 rpm 离心60秒,弃掉废液。 不含DNA酶操作步骤
- 注:第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量乙醇,加入后请及时打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
- 加入500μL去蛋白液RE,12,000 rpm 离心60秒,弃掉废液。
- 加入700μL漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000 rpm 离心60秒,弃掉废液。
- 加入500μL漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000 rpm 离心60秒,弃掉废液。
- 7.将吸附柱RA放回空收集管中,12,000 rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
- 8.取出吸附柱RA,放入一个RNase-free离心管中,根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加50-80μL RNase-free water(事先在 65-70℃水浴中加热效果更好), 室温放置2分钟,12,000 rpm 离心1分钟。如果需要较多RNA,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,离心1分钟, 或者另外再加30μL RNase-free water,离心1分钟,合并两次洗脱液。
- 核酸提取效果:
- 每100mg植物样本预期的RNA产量
- 1.拟南芥,35μg
- 2.玉米,25μg
- 3.烟草,60μg
- 【注意事项】
- 1. 为防止RNA降解,所有离心步骤如未加说明,均在4℃低温进行。
- 2. 裂解液PL和去蛋白液RE中含有刺激性有害化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
- 3. 预防RNase污染,在实际的操作中应遵循以下指南(参见《分子克隆》)
- * 全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌,可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。
- * 使用灭菌的、一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA,避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。
- * 使用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时,塑料器皿可以在0.5 M NaOH中浸泡10分钟,用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。
- 4. 常规的琼脂糖凝胶电泳和变性胶电泳均可以用来分析RNA的质量。好的RNA产物在电泳后应该可以看到明显的二条优势核糖体RNA带,分别为~5Kb(28S),~2Kb(18S),条带亮度比值约为2:1。有时候也可以看到~0.1kb和0.3Kb(5S,tRNA)带。但有时候根据不同的物种如某些植物组织可以看到4,5条带也属于正常现象,如果RNA未成熟的前体或者不均一核RNA、小核RNA提取出来也可能看到介于7Kb和15Kb之间的不连续的高分子量条带。
- 5. 检测OD260/OD280吸光度比值时,RNA样品应该溶于TE后检测,如果用水稀释后检测,由于一般水离子强度和PH值低,会使OD280升高,从而使比值降低。
- 疑难解答:
- 产量低
- 样品裂解或者匀浆不彻底
- 使用的样品或者裂解物在-20℃或者-70℃存放太久。
- 组织本身含RNA少
- 超过了吸附柱的最大吸附能力
- 漂洗液RW内忘记加乙醇
- OD260/OD280吸光度比值<1.6
- 分光光度计检测吸光度时,RNA样品不是溶于TE,而是溶于水。低离子浓度和低pH条件下,OD280值会较高,造成比值低。
- 污染了蛋白或者苯酚
- RNA降解,完整性不佳
- RNA提取所用各种物品和试剂没有灭活RNA酶
- 样本取出后没有马上处理或冷冻,提取前已经降解
- 提取的RNA样品没有保存在-20℃或-70℃低温
- 样品提取过程中降解
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