转基因大鼠制备服务

服务名称 ：转基因大鼠制备技术服务

提供商 ：赛业生物

与小鼠相比，大鼠体型较大，其生理学特征易于研究，是多种人类疾病的重要模式动物。


大鼠是研究生理学的理想模型，研究者已经得到了大量的纯系大鼠，并且在大鼠的行为、细胞、生理、生化、药理和毒理学方面积累了大量的数据；大鼠还是研究人类高血压、糖尿病、乳腺癌和神经系统疾病的理想动物模型。大鼠在形成乳腺癌等肿瘤时的激素反应和人非常相似。从某种程度上说，大鼠是目前最适合的人类疾病动物模型之一，是可以将基因组和功能结合起来的动物模型。


大鼠同时也是药理学研究的常用动物，并且被广泛应用于心血管疾病、运动疾病的研究领域。大鼠可以用来模拟几乎所有已知的人类疾病，了解大鼠的遗传结构将帮助研究人员发现与疾病相关的基因，从而更加清楚地认识基因以及环境对人类的健康造成的影响。大鼠一直广泛应用于药物的效力以及安全性测试工作，对大鼠基因组序列的了解，将为药物干涉提供新的目标，这将对新药的研制产生巨大的推动作用。


赛业目前大鼠项目可选的品系及其特点如下：


（1）SD大鼠：产仔多、生殖力强 、生长发育快、抗病能力强。自发肿瘤率低，对性激素感受性高。常用作营养学、内分泌学和毒理学等方面的研究。

（2）Wistar大鼠：性周期稳定，繁殖力强，生长发育快。性情温顺，抗病性强，自发肿瘤率低。广泛用于营养学、生理学、药理学、毒理学及病理生理学等的研究。

（3）F344(CDF)大鼠：旋转运动性差，血清胰岛素含量低，脑垂体大。可允许多种肿瘤移植生长，癌症发生的研究中应用较多。

（4）Long evans大鼠：广泛用于行为学、营养学、神经学、毒理学和眼科方面的研究。不易感染呼吸道疾病，对于需要延长吸入麻醉时间的外科手术有非常大的优势。

（5）Brown Norway大鼠：野生Norway大鼠的变种，毛呈褐色，最早用于遗传学研究。对实验性过敏性脑脊髓炎及自身免疫性复合型肾小球肾炎有抗性。


转基因鼠制作原理：

制作转基因鼠最常用的一种方法是DNA原核显微注射。DNA原核显微注射是指将外源DNA通过显微注射的方法注射到受精卵的原核内，注射DNA整合到大（小）鼠受精卵的基因组中，并稳定遗传给后代。 赛业所使用的PiggyBac系统DNA显微注射，制备的转基因鼠基因表达阳性率为常规质粒DNA显微注射的2倍以上！


PiggyBac系统打造高效转基因——技术原理：

PiggyBac (PB) 系统是利用PB转座子特有的“剪切和粘贴”机制，使DNA片段在载体和基因组之间“自由”的转移，从而有效介导外源DNA片段对基因组的整合。转座时，转座酶有效的识别特异的转座子序列(ITRs)，与转座子末端结合形成短暂的发夹结构，“剪切”后脱离，“粘贴”至基因组的TTAA位点。Cyagen实验数据表明，PiggyBac系统基因表达阳性率为常规质粒DNA显微注射的2倍以上！

PiggyBac （PB）系统五大优势：
1、更高的整合效率；
2、更高的目的基因表达概率；
3、更大的目的片段的插入；
4、更“精确”拷贝数的插入；
5、可自由移除插入片段。

服务流程和周期

动物品系：

C57BL/6小鼠：目前公布的小鼠基因组测序结果来源于C57BL/6小鼠品系。该品系小鼠模型已广泛应用于肿瘤、免疫、遗传学等方面的研究， 并已成为发表文章的主要小鼠品系。
FVB小鼠：原核大、清晰、近交品系，基因型比较单一；具有易于原核注射的优点。
SD大鼠：适合用于研究心血管、神经系统等器官发育的常用模式动物品系。


转基因大（小）鼠类型

1、过表达转基因大（小）鼠

构建上述常规的带有启动子和目的基因的表达载体， 利用原核显微注射的方法将表达载体注射到小鼠受精卵中。通过构建广泛性/组织特异性/诱导性等不同的启动子，实现转基因在小鼠组织广泛性/特异性/特定条件下等的表达，达到对目的基因功能的研究目的。

2、RNAi转基因大（小）鼠

通常采用U6/H1驱动shRNA表达，设计靶序列构建shRNA载体，利用原核显微注射的方法将shRNA载体注射到受精卵中。在基因表达的过程中，通过shRNAi的干扰作用，达到对目的基因表达的沉默抑制，实现基因功能的研究。

3、microRNA转基因大（小）鼠

构建上述两种microRNA过表达和下调载体，通过原核显微注射将载体注射到受精卵中，通过基因表达，实现microRNA过表达或者下调。

4、可诱导性/组织特异性转基因大（小）鼠

将构建的广泛表达启动子-lox-stop-lox-转基因载体通过显微注射制备组织特异性转基因大（小）鼠模型，转基因在正常情况下并不表达， 只有与相应的组织特异性表达Cre/CreERT2小鼠杂交后，因Stop终止序列在特定的组织中被去除，从而达到转基因在诱导性/特定组织中特异性表达 的目的。

5、BAC转基因大（小）鼠
Bacterial artificial chromosomes（BACs）是处理大片段DNA的重要工具。由于其完整性和保真度，可以更好的解释转基因的重要功能。因此，为了研究完整的时空特异性基因表达、基因结构及调控元件等，可以将BAC直接进行原核显微注射（约几十到几百Kb）或者将其改造后注射在小鼠或大鼠的受精卵中，以获得转基因鼠。

建系原则与流程

1、原核显微注射导入的目的基因是将目的基因随机整合到小鼠或者大鼠的基因组，因此首代转基因鼠（F0）将会有不同的整合位点。整合基因的拷贝数可能在不 同的首代转基因鼠中也不同。因此，每只F0代鼠需要作为一个独立的谱系研究，并且与其它F0代鼠分开进行繁殖。由于外源基因一般只整合在二倍体动物的其中 一条染色体上，属于半合子，其后代只有一部分个体带有整合的基因，需要进行筛选鉴定。
2、原核显微注射获得PCR阳性F0代杂合子鼠。
3、F0代鼠达到性成熟后（8周）与野生型鼠进行交配，获得F1代鼠。
4、对交配获得的F1代鼠进行基因型鉴定，理论上，F1代鼠中有50%为转基因杂合子鼠，50%为野生型鼠。


注意事项：
1）每只F0代鼠基因型都不一样，不能进行F0之间的自交，只能先与野生型交配，筛选出基因型一致的F1。（假如F0代有多个位点的外源基于整合，F1还有可能有多种基因型）。
2） 获得F1鼠后，可以进行蛋白表达鉴定，优先筛选出表达的鼠后再进行后续的传代和保种。

转基因大鼠的鉴定：
用DNA原核显微注射的方法建立的转基因大鼠，外源基因在大鼠基因组上的插入是随机的，并且常呈现成串的头尾相接的多拷贝的插入，拷贝数可以高达几十个。外源基因在染色体上的插入位点一般是一个，少数情况下也可能是多位点插入。我们通常采用PCR的方法来鉴定外源基因是否成功的整合到大鼠基因组中。
大鼠出生后大约7天左右，剪取其脚趾并提取基因组进行PCR鉴定，检测目的基因是否整合到大鼠基因组中。