蛋白质游离巯基含量检测试剂盒 微量法

蛋白质游离巯基含量检测试剂盒说明书
微量法
货号：BC5895
规格：100T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称	规格	保存条件
提取液一	液体40 mL×1瓶	2-8℃保存
提取液二	液体40 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂一	液体120 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂二	液体20 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂三	液体7 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂四	液体1mL×1支	2-8℃保存
标准品	粉剂×1支	2-8℃保存

溶液的配制：

1. 提取液配制：临用前根据样本量按照提取液一：提取液二=1mL：1 mL进行配制，请勿一次性全部混合。
2. 若试剂二有析出，可置于37℃水浴加热至澄清透明后使用。
3. 标准品：10mg还原型谷胱甘肽（GSH）。临用前加入1.3mL蒸馏水配置成25μmol/mL，2-8℃保存4周。
4. 0.125μmol/mL标准品配制：取50μL 25μmol/mL标准品，加入950μL蒸馏水，充分混匀，配制成1.25μmol/mL的标准品；然后取100μL 1.25μmol/mL标准品，加入900μL蒸馏水，充分混匀，配制成0.125μmol/mL的标准品备用，现配现用。

产品说明：
巯基的存在使得蛋白质能够进行二硫键的形成，从而维持分子的稳定性和功能性。此外，巯基还参与到氧化还原反应中，具有重要的生物学作用。在细胞内，巯基含量的变化与多种疾病的发生和进展密切相关，因此巯基也成为了生物医学领域中的重要研究对象。本试剂盒测定的是蛋白质中的游离巯基含量。
一定条件下巯基会发生亲核反应，即巯基与5,5’-二硫代-双-硝基 苯甲酸（DTNB）反应，生成黄色化合物，在412nm处有最大吸收峰，据此可以计算蛋白质游离巯基含量。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、天平、低温离心机、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、丙 酮（AR）、蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，3000rpm 离心10min，弃上清。在沉淀中加入2mL试剂一，搅匀后溶解沉淀，沉淀溶解液作为样本进行实验。（注：（1）植物叶片等纤维含量较高的样本，溶解沉淀后4℃ 3000rpm离心3min，取上清作为样本进行实验,；（2）加入试剂一后会有大量气泡产生，请缓慢加入，建议使用5mL的EP管）。
2. 细菌/细胞：按照细菌/细胞数量（10⁶个）：提取液体积（mL）为5~10：1的比例（建议5百万细菌/细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎（功率200W，超声3秒，间隔10秒，总时间3min）后，于4℃，3000rpm 离心10min，弃上清。在沉淀中加入2mL试剂一，搅匀后溶解沉淀，沉淀溶解液作为样本进行实验。（注：（1）若沉淀溶解不完全，可4℃ 3000rpm离心3min，取上清作为样本进行实验；（2）加入试剂一后会有大量气泡产生，请缓慢加入，建议使用5mL的EP管）。
3. 血清/血浆、牛奶等液体：取100μL液体样本加入0.9mL丙 酮，4℃，3000rpm 离心10min，弃上清。在沉淀中加入2mL试剂一，搅匀后溶解沉淀，沉淀溶解液作为样本进行实验。（注：若测定数值偏小，可改变样本与丙 酮的比例，如取0.2mL液体样本加入0.8mL丙 酮或0.3mL液体样本加入0.7mL丙 酮，注意同步修改计算公式）。

二、测定步骤

1. 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm，分光光度计用蒸馏水调零。
2. 操作表：（建议在2mL的EP管中操作）

试剂名称（mL）	对照管	测定管	空白管	标准管
样本	0.3	0.3	-	-
蒸馏水	-	-	0.3	-
标准品	-	-	-	0.3
提取液	0.18	0.18	0.18	0.18
请缓慢加入提取液混匀，并用吸头反复吹打至气泡不再产生（期间会有大量气泡产生，开盖放置）			-	-
试剂二	0.18	0.18	0.18	0.18
充分混匀，4℃ 3000rpm离心10min后取上清于1.5mL EP管/96孔板中			-	-
上清液	0.14	0.14	0.14	0.14
试剂三	0.06	0.05	0.05	0.05
试剂四	-	0.01	0.01	0.01
充分混匀，室温静置10min后，412nm下测定吸光度，分别记为A对照、A测定、A空白、A标准。计算ΔA测定=A测定-A对照，ΔA标准=A标准-A空白。空白管和标准管只需测1-2次。每个测定管需设一个对照管。

三、蛋白质游离巯基含量的计算

1. 按照样本蛋白浓度计算：

蛋白质游离巯基含量（μmol/mg prot）=ΔA测定÷（ΔA标准÷C标准）×V样本÷（V样本×Cpr）×F
=0.125×ΔA测定÷ΔA标准×Cpr×F

1. 按照样本质量计算：

蛋白质游离巯基含量（μmol/g 质量）=ΔA测定÷（ΔA标准÷C标准）×V试剂一÷W×F
=0.25×ΔA测定÷ΔA标准÷W×F

1. 按照液体体积计算：

蛋白质游离巯基含量（μmol/mL）=ΔA测定÷（ΔA标准÷C标准）×V试剂一÷V液样×F
=2.5×ΔA测定÷ΔA标准×F

1. 按照细胞/细菌数量计算：

蛋白质游离巯基含量（μmol/10⁶ cell）=ΔA测定÷（ΔA标准÷C标准）×V试剂一÷N×F=0.25×ΔA测定÷ΔA标准÷N×F
C标准：标准管浓度，0.125μmol/mL；V样本：加入的样本体积，0.3mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，蛋白浓度需自行测定；W：样本质量，g；V试剂一：提取时加入试剂一体积，2mL；V液样：提取时加入的样本体积，0.1mL；F：稀释倍数；N：细胞/细菌总数，以10⁶计。
注意事项：

1. 若样本ΔA测定<0.01，可适当增大样本量后测定，注意同步修改空白管和标准管及计算公式；若样本ΔA测定>1.5，可用试剂一稀释沉淀溶解液后测定，注意同步修改计算公式中的稀释倍数。
2. 可使用BCA法测定蛋白浓度。

实验实例：

1. 取100μL马血清，按照测定步骤操作，用96孔板测得ΔA测定=A测定-A对照=0.113-0.047=0.066，ΔA标准=A标准-A空白=0.417-0.105=0.312，按样本液体体积计算蛋白质游离巯基含量得：蛋白质游离巯基含量（μmol/mL）=2.5×ΔA测定÷ΔA标准×F =0.529μmol/mL。
2. 取0.1036g鼠肝，按照测定步骤操作，用96孔板测得ΔA测定=A测定-A对照=0.261-0.105=0.156，ΔA标准=A标准-A空白=0.417-0.105=0.312，按样本质量计算蛋白质游离巯基含量得：蛋白质游离巯基含量（μmol/g 质量）=0.25×ΔA测定÷ΔA标准÷W×F =1.207μmol/g 质量。
3. 取0.1078g黄豆粉，沉淀溶解液用试剂一稀释2倍后，按照测定步骤操作，用96孔板测得ΔA测定=A测定- A对照=0.123-0.070=0.053，ΔA标准=A标准-A空白=0.417-0.105=0.312，按样本质量计算蛋白质游离巯基含量得：蛋白质游离巯基含量（μmol/g 质量）=0.25×ΔA测定÷ΔA标准÷W×F =0.788μmol/g 质量。

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