文献支持Western Blot技术服务，WB免疫印迹实验代测

服务名称 ：Western Blot技术服务 WB免疫印迹服务

提供商 ：上海信帆生物

Western Blot技术服务，WB免疫印迹实验代测

本司提供内参费用：0元

检测时间2-3周，提供图片，原始图片，数据，实验操作步骤，仪器型号等等

免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting)，它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA 结合蛋白和其相关的DNA 结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术初用于研究DNA 结合蛋白，目前已用于研究RNA 结合蛋白和特定的RNA 序列的相互作用。

Western blot 检测	1500元/膜	每张膜1--8样本
EMSA	2800元/膜	每张膜1--8样本，包括探针及试剂

老师在做 免疫印迹（WB）实验时候，需要先告知我司销售人员是做整模还是减膜，具体如图。另外本公司提供大膜和小膜两种规格的膜，大膜一个指标可以测1到13个样本，小膜一个指标可以测1-8个样本。

整膜如图：

 

减膜如图：

 

Western blot样本要求

客户需新鲜或正确保存的蛋白样品， 检测目的蛋白的一抗（或由本公司代购）。样品要求为：

1、裂解样品总蛋白量>500ug/样品。

2、细胞样品总蛋白浓度>1mg/ml。

3、组织样品总蛋白浓度>10-15mg/ml。
 

Western blot结果及数据提供

内参蛋白和目的蛋白曝光胶片各一张，可提供扫描图，实验报告，包括整个试验流程所涉及的实验数据和实验步骤。如需进行蛋白纯化服务，将提供检测报告

WB实验代测

服务内容

我们提供从蛋白制备、蛋白电泳到Western blot检测的全流程服务，如需要还可进行灰度分析。

说明

1、建议提供目的蛋白阳性表达样品（纯蛋白或有阳性表达的细胞或组织）作为阳性对照。

2、每张膜检测1-8个样品。

3、如果一抗由客户提供，请在正确条件下保存，避免污染及反复冻融。

关于Western blot实验异常分析

『无信号』

原因	建议
一抗与二抗不匹配	选择针对一抗来源种属制备的二抗；
一抗不识别目的的种属的蛋白	1)检查抗体的说明书，适用范围内是否包含目的种属            2)使用阳性对照来检查抗体质量
一抗或二抗不足，没有足够的抗体结合到目的蛋白	1)降低抗体稀释倍数，增加抗体浓度            2)延长孵育时间
封闭剂与一抗有交叉反应	改变封闭剂
抗原不足	1)每个泳道加入20-30ug总蛋白            2)制备样品要使用蛋白酶抑制物及使用阳性对照
在检测的组织内目的蛋白表达水平低	检测样本不表达目的蛋白选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性，也可更换细胞系
蛋白转膜效率低	1)利用丽春红检测转膜效率;检查转移装置是否电极弄反            2)转移前膜是否用甲醇侵泡过
膜过渡洗涤	减少洗涤时间和强度
抑制二抗活性	二抗稀释液内不用钠

 

 

『没有特异条带』

原因	建议
细胞系传代过多后蛋白表达谱发送变化	1)使用未传代或传代次数较少的细胞系进行样品制备
蛋白本身有很多修饰	1)查阅文献，确定目的蛋白是否存在多种修饰
蛋白被消化或者降解	1)蛋白样品确保未被污染，确保含有蛋白酶抑制剂
所检测蛋白存在多种剪接体，导致分子量大小不同	1)查阅文献或者通过搜索数据库来确定该蛋白是否存在多种长度不同的编码mRNA
一抗或二抗浓度高	1)减低抗体浓度
洗涤不够	1)充分洗涤

 

 

『条带大小不正确』

原因	建议
目的蛋白被降解	确保蛋白样品未被污染，确保含有蛋白酶抑制剂
存在不同的剪接体	查阅文献或者通过搜索数据库来确定该蛋白是否存在多种长度不同的编码mRNA
重组蛋白	检测是否存在额外加入的蛋白
特殊蛋白如MDM2等	仔细阅读抗体说明书

 

 

 

尊敬的客户：
本公司有放射免疫技术服务、蛋白质组学服务、免疫组化、PCR技术服务、生物信息学数据分析等，如果您想了解Western blot的更多内容或者其他服务信息，您可以本公司的了解更多产品的详细信息，至善至美的服务是我们永无止境的追求，欢迎新老客户放心选购自己心仪产品，我们将竭诚为您服务！

 

WB实验代测

上海信帆实验服务项目:ELISA,免疫组化,免疫印迹Western Blot,放射免疫,实时荧光定量ＰＣＲ,，免疫组织，特殊染色,病理学检测技术服务等等!我们拥有很棒的实验室,客户检测项目均提供实验室仪器型号,提供操作详细步骤.

Western Blot技术服务，WB免疫印迹实验检测
成功完成Western Blot检测，必须满足4个条件：

凝胶洗脱：转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来，如果蛋白质还截留在凝胶中，将无法在膜上进行分析

吸附到膜上：在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上，如果蛋白不吸附，将无法在膜上进行分析

处理期间仍截留在膜上：在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上

处理过程中可接近：被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触，如果蛋白质被掩盖则无法检测

成功进行WB检测，则设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到WB的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！一般需要设置的对照如下：

阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率

阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性

二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性

内参对照：检测标本的质量和二抗系统

空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果

Western Blot技术服务，WB免疫印迹实验检测

WB 检测基本过程

1 、获取细胞或组织裂解物

1)根据检测蛋白的位置选择合适的裂解buffer：

蛋白位置	推荐buffer
全细胞	NP-40 or RIPA
胞浆（可溶性蛋白）	Tris-HCl
胞浆（骨架结合蛋白）	Tris-Triton
膜蛋白	NP-40 or RIPA
核蛋白	RIPA or 核蛋白提取试剂盒
线粒体蛋白	RIPA or 线粒体分离试剂盒

亦可购买商业化的蛋白提取试剂盒来保证标本制备的质量

Western Blot技术服务，WB免疫印迹实验检测

2)选择合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性！

2 、蛋白定量

常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根据情况将标本保存在-20°C /-80°C备用，进行免疫沉淀（IP）或者直接进行电泳分离蛋白

3 、电泳分离蛋白质

根据待测蛋白状态确定电泳条件：

待测蛋白状态	凝胶条件	上样buffer	电泳buffer
Reduced - Denatured	还原，变性	含β-巯基乙醇或DTT，含SDS	含SDS
Reduced - Native	还原，不变性	含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS	不含SDS
Oxidized - Denatured	不还原，变性	不含β-巯基乙醇或DTT，含SDS	含SDS
Oxidized - Native	不还原，不变性	不含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS	不含SDS

根据待测蛋白分子量大小确定凝胶浓度

蛋白分子量（kDa）	凝胶浓度（％）
4-40	20
12-45	15
10-70	12.5
15-100	10
25-200	8

4 、转膜

根据不同的检测目的和待测蛋白的特性,选择合适的膜类型。常用的转移膜类型有:PVDF膜、硝酸纤维素膜（NC膜）和尼龙膜，其中PVDF和NC膜的使用频率高。各种膜的技术参数及比较如下：

	PVDF膜	NC膜	尼龙膜
灵敏度和分辨率	高	高	高
背景	低	低	较高
蛋白结合能力	100-200ug/cm2（适用于SDS存在时与蛋白结合）	80-100ug/cm2	>400ug/cm2
机械强度	强	干的膜易脆	软而结实
溶剂抗性	强	差	差
使用前是否需要浸润	100%甲醛润湿	缓冲液润湿	缓冲液润湿
适用染色方法	胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁、考马斯亮兰	胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁	不能用阴离子染料
适用检测方法	显色法、化学发光、荧光、放射性、化学荧光、快速免疫检测	显色法、化学发光、荧光、放射性	显色、化学发光、放射性
适用范围	普通蛋白WB、糖蛋白检测、蛋白质测序、氨基酸分析、重复检测	普通蛋白WB、氨基酸分析、重复检测。0.1um膜适用于7kDa以下蛋白	低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸检测常用
价格	高	较低	低

5 、封闭

去掉膜上多余的非特异性结合位点，降低背景。常用的封闭溶液有：含BSA或者脱脂奶粉的TBST或TBS

6 、一抗孵育

一抗的选择成功与否，是整个WB实验成功的关键：选择一抗有以下几个注意点：

选择适合检测标本种属的一抗（说明书有验证）

选择适用于WB实验方法的一抗（说明书有验证）

选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体

一抗的保存和使用：

根据说明书的要求条件进行抗体的保存；一般需要将抗体分装后放入-20度保存，绝对避免反复冻融。

抗体的工作液好现配现用，在4度保存好不要超过2周

根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。由于实验室条件和检测方法等的差异，说明书推荐的稀释比例只作参考，需要在说明书推荐的浓度周边进行多个浓度梯度的实验检测，然后选择信噪比好的抗体浓度进行实验。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索佳稀释度（1:100-1:3000）。

孵育条件：推荐4°C孵育过夜（一般大于18个小时），根据抗体亲和力不同孵育时间有所区别

内参的选择和使用：WB 过程监测以及目的蛋白定量的标准！

Western Blot技术服务，WB免疫印迹实验检测

WB常用内参及其技术参数：

内参名称	分子量大小	适用范围
beta-actin	43kDa	胞浆和全细胞
GAPDH	30-40kDa	胞浆和全细胞
Tubulin	55kDa	胞浆和全细胞
VCDA1/Porin	31kDa	线粒体
COXIV	16kDa	线粒体
TBP	38kDa	细胞核

详情请参考

7 、二抗孵育

根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索佳稀释度（1:1000-1:20000）。孵育条件一般为室温1-2小时

8 、底物孵育

选择显色或者化学发光底物。一般倾向于化学发光，灵敏度高且背景低，节省抗体用量

9 、结果分析和检测

凝胶成像系统检测或者暗室曝光到胶片

注意事项
1、 抗体：事先咨询信帆生物，明确抗体种属及指标名称，确定我司抗体库否有该抗体可使用，如有一抗可免费提供，如无可由双方协商而定，客户自己购买提供或我公司代购；
2、 标本收集与保存：
组织样品 新鲜组织放入液氮或-70度保存，组织不少于100mg（约绿豆大小）；
培养细胞 通过细胞计数取不少于100万个细胞于EP管，加入0.5ml生理盐水或蛋白保护剂，混匀后保存于冰箱（-70℃，避免反复冻融）；
血液细胞标本 以抗凝管保存血样或以淋巴细胞分离液分离细胞后加入0.5ml生理盐水或蛋白保护剂，保存（-70℃可长期保存，避免反复冻融）
血清或细胞培养液标本 离心去掉杂质后取上清入EP管，保存（以上4℃可保存15-20天，-70℃可长期保存，避免反复冻融）
3 、 样本运输：可选以下任何的一种方式寄送标本
组织样本、细胞样本以干冰运输或加入蛋白保护剂后加冰袋运输；
细胞样本也可以直接快件寄送培养瓶（密封保证不污染，培养液不漏出，细胞不要长得太满，50%左右，灌满培养液）；
血清或上清液直接加冰袋寄送（密封保证液体不漏出，视路途远近2-3天可到达）。

流程：
1、客户告知实验分组、编号、检测样本类型、种属、指标，有具体要求请事先说明；
2、签订合同，寄送样本和抗体，如需我方提供抗体请事先说明；
3、客户支付预付款，进行实验。
4、提供原始数据，分析数据，实验室仪器型号，所用试剂品牌货号，图片，实验报告等！

Western Blot技术服务，WB免疫印迹实验代测