逆转录病毒包装纯化-和元生物

服务名称 ：逆转录病毒包装纯化

提供商 ：OBiO和元生物

规格 ：TU/ml

逆转录病毒包装纯化实验报告

摘要：和元生物使用兼嗜性逆转录病毒包装系统获得高滴度的过表达EGFP基因的逆转录病毒颗粒。该逆转录病毒系统中外源基因的表达框为pRetro-CMV-EGFP-3FLAG-SV40-Puro：CMV启动子驱动EGFP基因的表达，同时由SV40启动子驱动puromycin抗性基因的表达， 用于快速筛选稳定细胞株。
关键词：兼嗜性逆转录病毒包装系统，EGFP，高滴度逆转录病毒包装，逆转录病毒纯化，和元生物

一、 实验原理
逆转录病毒是需在逆转录酶的作用下首先将RNA转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增的一类病毒。逆转录病毒是RNA病毒，它有三个基因：gag-编码病毒的核心蛋白；pol-编码逆转录酶；env-编码病毒的被膜糖蛋白。逆转录病毒的DNA插入宿主细胞染色体时，在5’LTR的U3左端和3’端LTR的U5右端各丢失2 bp，而在宿主染色体插入位点上生成4～6 bp的重复序列。逆转录病毒的DNA基因组整合在宿主染色体上的位点是随机的。每个受感染的细胞一般有1～10份前病毒拷贝。逆转录病毒DNA的整合是复制病毒RNA的必经阶段。只有当受感染细胞处于细胞分裂期间，逆转录病毒DNA基因组才能接触到宿主细胞的遗传物质。因此，逆转录病毒只能在分裂中的细胞内复制。
逆转录病毒可以与多种细胞表面蛋白结合而进入细胞，其宿主细胞范围很广。逆转录病毒的亲嗜性存在物种之间的差异，据此可将其分为三类：（1）单嗜性逆转录病毒（ectropic retrovirus），只感染小鼠和少数几个品种的大鼠；（2）兼嗜性逆转录病毒（amphotropic retrovius），能感染小鼠的细胞，也能感染其他种属动物的细胞；（3）异嗜性逆转录病毒（xenotropic retrovirus），能感染多种动物细胞，但不能感染小鼠细胞。目前使用较多的是兼嗜性逆转录病毒，即以兼嗜性包装细胞包装病毒颗粒。逆转录病毒的宿主范围由病毒颗粒表面的包被蛋白（Env）决定，病毒基因组不影响其靶向性，不同的基因组可用相同的Env包被，且Env来自何种病毒，包装出的病毒颗粒就叫该病毒的假病毒。
逆转录病毒载体系统共由两部分组成：包装细胞系和缺陷病毒本身。在逆转录病毒载体中，去除了正常的蛋白编码序列而保留了复制和包装信号，通过分子克隆技术将目的基因插入此载体上，而包装细胞系能提供病毒载体包装成病毒粒子所需的结构蛋白。当重组病毒载体导入包装细胞后，缺陷病毒载体和包装细胞的互补作用共同完成病毒装配，该病毒颗粒可感染其他宿主细胞，此时目的基因进入该细胞并整合到细胞基因组中，导致插入序列在宿主细胞中表达，产生目的蛋白.宿主细胞不能像包装细胞那样为缺失结构基因的逆转录病毒提供结构蛋白，因而在宿主细胞内不会产生新的感染性病毒颗粒，保证了该载体在生物制品领域的生物安全性问题。
逆转录病毒的许多特点便于其发展成为动物基因克隆载体。①就目前所知，在大多数情况下，逆转录病毒的肿瘤基因（oncogene，ONC）都能够在细胞中转录。这种特性说明逆转录病毒有可能是一种天然的转录因子，同时根据这种特性，可以在正常细胞中进行操作，将它改建为有用的动物基因转移载体。②逆转录病毒的寄主范围相当广泛，包括无脊椎动物，其中有的还能够在人体细胞中生长；③逆转录病毒不但感染效率高，而且通常不会导致寄主细胞的死亡，被它感染的或转化的动物细胞能够持续许多世代，保持正常生长和保持病毒感染性的能力。

逆转录病毒载体最大优点：
(1) 转染范围广，可以感染各种细胞类型，如淋巴细胞或肝细胞、肌细胞等;
(2) 转入的外源基因可完全整合；
(3) 对细胞感染率高，达到100 %；
(4) 感染细胞不产生病变，可建立细胞系长期持续表达外源基因。

二、 实验目的
和元生物使用兼嗜性逆转录病毒系统获得高滴度的过表达EGFP基因的慢病毒颗粒，用于测定细胞的MOI或者标记细胞。

三、 实验步骤
1. 和元生物载体选择及构建

过表达逆转录病毒载体
2. 和元生物病毒包装
包装细胞准备：
1) 细胞复苏
a) 准备适当的灭菌培养瓶，标上细胞系名称、传代数和日期；
b) 液氮罐中取出冻存的细胞，并在密封容器中转移到实验室中；
c) 将细胞从容器中拿出到适当温度中的水浴箱中，用37水浴。只浸没冻存管的下半部分，解冻到冻存管中只剩少量固体，通常需要1-2min，迅速转移到生物安全柜中；
d) 用70%酒精棉擦拭冻存管的外部，并在无菌打开冻存管；
e) 慢慢的用移液管逐滴移至37℃温育过的培养液中，用以稀释冻存液中的DMSO；
f) 在37℃，5%CO2中进行培养；
g) 24h后倒置显微镜观察细胞状态，如果有必要需进行传代。

2) 细胞传代
a) 倒置显微镜观察细胞，评估细胞汇合的程度以及确认无细菌和真菌污染；
b) 移去培养瓶中的培养液；
c) 相当于培养液体积一半的PBS清洗单层细胞，一般三次即可；
d) 按1mL/25cm2表面积的量加入0.25%胰酶消化单层细胞。摇晃培养瓶使其胰蛋白酶覆盖细胞单层，倒出多余的胰蛋白酶；
e) 将培养瓶放回培养箱，放置2-10min；
f) 用倒置显微镜观察细胞以确保所有细胞都分离且漂浮，轻拍培养瓶的一侧来释放残留的贴壁细胞；
g) 用少量的含新鲜血清的培养液重悬细胞以灭活胰蛋白酶，取出100-200μL用于计数；
h) 将所需数量的细胞移至一个新标记好的含温育过培养液的培养瓶中或者培养板上；选择适当培养条件培养细胞系；
i) 按照细胞系的生长特性重复该步骤，直到细胞状态良好、无污染，可以铺板使用，其余选择冻存。
3) 活细胞计数
a) 取一瓶传代的细胞，待长成单层以后使用；细胞悬液的制备方法：用0.25%的胰酶消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。
b) 盖好盖玻片，取一套血球计数槽，制备计数用的细胞悬液：用吸管吸适量细胞悬液到离心管中，加入等体积台盼蓝染液，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。若仅是单纯的进行细胞计数，不考虑细胞的活力，则可不使用台盼蓝染色；
c) 将细胞悬液滴入计数板，注意盖玻片下不要有气泡，也不要悬液流入旁边槽中；
d) 统计四个大格的细胞数，将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的大格（每格含有16个中格）中没有被染液染上色的细胞数目；
e) 计算原细胞悬液的细胞数。按照下面公式计算细胞密度：
（细胞悬液的细胞数）/mL=（四个大格子细胞数/4）×2×104
说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。
公式中乘以2因为细胞悬液于染液1：1稀释。
1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）=0.1mm3；1mL=1000mm3

4) 细胞冻存
用倒置显微镜观察细胞，评估细胞密度以及确认无细菌和真菌污染，移去培养瓶中的培养液，用相当于培养液体积一半的PBS清洗单层细胞，一般三次即可，按1mL/25cm2表面积的量加入0.25%胰酶消化单层细胞。摇晃培养瓶使胰蛋白酶覆盖细胞单层。倒出多余的胰蛋白酶，将培养瓶放回培养箱，放置2~10min，用倒置显微镜观察细胞以确保所有细胞都分离且漂浮，轻拍培养瓶的一侧来释放残留的贴壁细胞，用少量的含新鲜血清的培养液重悬细胞以灭活胰蛋白酶。取出100~200μL用于计数。为了冻存后有好的复苏效果，理想细胞的存活率应超过90%。将剩余的细胞150g离心5min，在冻存培养液中，以2~4×106个细胞/mL的密度重悬细胞，吸取1mL细胞悬液转移至标有细胞系名称、传代次数的冻存管中，将冻存管放置冻存盒中放入-80℃冰箱过夜，最后将冷冻的冻存管转移到液氮的气相层内存放，并记录位置。
逆转录病毒包装过程
1) 包装过程（以100mm dish为例）：
a) 转染前一天，将细胞接种到100mm dish中，控制细胞转染时的密度为70-80%。
b) 转染前一小时取出细胞培养板，去除原有细胞培养基，加入10mL的Opti-MEM培养基，将细胞放回培养箱
c) 制备转染试剂和质粒的复合物：
• 将待转染的病毒载体质粒24μg（骨架质粒：穿梭质粒=1:1）溶于Opti-MEM培养基，总体积为500μL，轻轻混匀，静置5min；
 将Obio转染试剂溶于Opti-MEM培养基，总体积为500μL，轻轻混匀，静置5min；
 将Obio转染试剂稀释液滴加到质粒稀释液中，边加边轻轻混匀后在室温放置20min，使DNA和Obio转染试剂充分结合形成稳定的转染复合体。
 取出细胞培养板，将上面配好的DNA- Obio转染试剂复合体加入到细胞培养板中，做好标记，放回培养箱；
 6h后吸去培养基，PBS洗一次，加入10mL新鲜完全培养基培养；
关于病毒转染试剂及转染信息，请登陆网站：http://www.oobio.com.cn/

2) 包装荧光拍照质控结果

3) 收毒
a) 转染48h后，第一次收毒，收集培养基至50mL离心管中，做上标记，并给细胞更换新鲜的完全培养基。
b) 转染72h后，第二次收毒，收集培养基至50mL离心管中，做上标记，丢弃细胞。
注：废弃的含病毒的培养基加入84消毒液（1:20左右），浸泡一天后丢弃。接触过病毒的枪头，离心管，培养板等其他物品可用84消毒液稀释液处理，也可以用煮沸处理半小时或高压湿热灭菌（121℃，30min）。

3. 和元生物逆转录病毒纯化
1) 普通离心机：3500rpm，10min，RT离心后，上清马上倒入新的50mL离心管，0.45μm，过滤上清到超速离心管中。上清分装到12支超速离心管，两两对应配平衡，不够的体积可用不含血清的培养基配平。
2) 超速离心机：HITACHI，25,000rpm，1h，4℃，离心后，可观察到管壁一侧有白色的病毒沉淀，做上记号。在安全柜中，打开离心管，小心地弃上清，离心管倒扣在灭菌过的吸水纸上，弃未去除干净的上清。每管根据沉淀量添加一定体积PBS溶解沉淀，按要求分装病毒，标记（病毒名称，年-月-日），-80℃冰箱保存。

4. 和元生物逆转录病毒滴度检测（测试DAP浓度）
1) 溶解冻存的NIH3T3细胞系并传代。（步骤详见溶解冻存的细胞系和传代细胞系）
2) 准备poly-lysine coated 12 well culture cluster。即每孔加入1mL poly-lysine溶液过夜。
3) 将传代的细胞接种到12 well 培养板，每孔约5X104个细胞。
4) 24h后，换含有不同稀释浓度病毒颗粒的DMEM-C（每孔1mL），一般稀释浓度为：1/10,000； 1/50,000；1/100,000。（每个浓度至少2个孔）
5) 3-5天后，4%PFA固定细胞，做BCIP/NBT染色。
6) 数蓝色细胞集落，得各个浓度平均每孔的集落数目。（如1/50,000的平均每孔50个集落，那么Viral titer 是50x50,000 CFU/mL，clone forming unit）

滴度结果图片

5. 和元生物逆转录病毒表达检测
逆转录病毒感染工具细胞-293T，WB检测病毒表达情况（24孔板为例）
第一天：细胞准备
将长势良好的293T细胞接种到24孔板，消化好细胞后把细胞浓度调为1×105个/mL，按500μL/孔加入。接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染时细胞汇合率介于30-50%之间。
第二天：病毒感染
感染实验分两组，按MOI 10、20加入病毒数。加入感染增强剂，终浓度为5μg/mL。
第三天：换液
感染8-12h后，弃去上清，换新鲜的完全培养基，500μL/孔。
(注：某些特殊细胞需要更换一半病毒液后，过夜，具体请咨询公司技术支持信箱：techservice@oobio.com.cn)
第五天：观察荧光表达情况，收集蛋白样品，进行WB实验。

四、 和元生物参考文献：
1. Miller, A. D., and C. Baltimore. Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production. Mol. Cell. Biol. 1986（6）:2895-2902.
2. Mann, R., R. C. Mulligan, and D. Baltimore. Construction of a retrovirus packaging mutant and its use to produce helper-free defective retrovirus. Cell 1983（33）:153-159.
3. Morita S, Kojima T, Kitamura T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Ther. 2000 Jun;7(12):1063-6.
4. Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006 Aug 25;126(4):663-76.