miRNA质粒构建（microRNA质粒构建）-和元

服务名称 ：和元miRNA过表达质粒构建（microRNA质粒构建服务）

提供商 ：OBiO和元生物

规格 ：按周期

hsa-mir-21过表达载体构建

摘要：和元以基因组DNA为模板扩增hsa-mir-21前体序列，并构建入慢病毒载体pGIPZ。在该载体中hsa-mir-21前体序列被插入到tGFP以及puromycin抗性基因的3‘UTR区。tGFP利于后续的表达观测， 而puromycin抗性基因则利于稳定细胞株的筛选。测序证实载体构建成功，该载体既可用于瞬时转染细胞，也可以包装成慢病毒用于稳定株的筛选以及在动物水平过表达hsa-mir-21。
关键词：microRNA，过表达， hsa-mir-21， puromycin， lentivirus vector

一、 实验原理
和元以人基因组DNA为模板PCR扩增hsa-mir-21基因前体序列，并构建入慢病毒载体pGIPZ中。

二、 实验目的
和元构建既可用于瞬时转染又可用于稳定株筛选的hsa-mir-21过表达慢病毒载体。

三、 和元实验方法
和元以人基因组DNA为模板PCR扩增hsa-mir-21基因前体序列，并构建入慢病毒载体pGIPZ中。表达载体酶切后回收线性化的载体片段。目的基因片段与线性化的载体片段经同源重组后转化E.coli感受态细胞。用菌落PCR鉴定转化子，阳性克隆送测序。测序无误的克隆进行质粒抽提。

1. 引物设计：
和元从GenBank中查询目的基因上下游的序列，用VectorNTI软件进行引物设计。
PCR扩增目的片段：
使用高保真的PrimeSTAR酶扩增目的片段，反应体系和条件如下：

2. 琼脂糖凝电泳检测PCR扩增结果：
和元目的片段PCR扩增成功后，进行琼脂糖凝电泳检测①，通过和DNA Maker的对比，判断目的片段是否扩增成功。
3. 胶回收目的片段：
和元把目的片段条带从琼脂糖凝电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收，具体步骤步骤参考试剂盒说明书。
4. 线性化表达载体的制备：
和元用限制性内切酶对检测载体的进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg， 10 x反应Buffer 5μL，限制性内切酶各1μL，用水补足50μL，于37℃水浴锅孵育2h以上。酶切产物进行进行琼脂糖凝电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收。
5. 目的片段同源重组到线性化检测载体中：
和元将目的DNA片段和线性化载体以摩尔比2:1加到Ep管中进行重组反应：

6. 感受态细胞的制备和转化：
和元的DH5α感受态细胞的制备和转化，详见《精编分子生物学实验指南》②
7. 菌落PCR鉴定阳性转化子：
和元将挑取平板上长出的转化子重悬于10µl LB培养液中，取1µl做模板进行菌落PCR鉴定。反应体系和PCR循环条件如下：

8. 阳性克隆送测序：
和元菌落鉴定得到的阳性克隆，送公司进行测序验证。软件比对测序结果并分析。
9. 质粒小提：
和元测序通过的阳性克隆，安排质粒小提。具体步骤见试剂盒说明书。

四、 和元实验结果
1. PCR扩增目的片段：
和元用正向引物CAACAGAAGGCTCGAGGATCTTAACAGGCCAGAAATG（引物说明：含同源重组序列、Xho I酶切位点，并含有目的基因5’端配对序列用于PCR扩增目的基因），反向引物ATTCTGATCAGGATCCCTAAGTGCCACCAGACAGAAG（引物说明：含同源重组序列、BamH I酶切位点下划线标记的，并含有目的基因3’端配对序列用于PCR扩增目的基因）对人基因组DNA进行扩增，预期PCR产物大小为339 bp，电泳结果如下：

DL2,000 DNA Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp

2. 表达载体的线性化
和元用Xho I和BamH I对表达载体进行双酶切，胶回收约11kb的载体片段，酶切图谱如下：

1kb DNA ladder Marker：10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、•1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp

3. 菌落PCR鉴定阳性克隆
和元用菌落PCR鉴定转化子，正向引物MIR30-F ATGAGGCTTCAGTACTTTACAG位于目的基因多克隆位点的上游；反向引物WPRE-R CATAGCGTAAAAGGAGCAACA位于目的基因下游的WPRE序列中。阳性克隆得到737bp条带，空载体对照得到434bp。电泳结果如下：
 

1. 阴性对照（H2O）
2. 阴性对照（空载体）
3. DL2,000 DNA Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
4~11 挑取的8个转化子
接种阳性克隆，保种并分装100μL送测序。测序没有问题的，再接种抽提质粒。

4. 测序结果分析
和元黄色荧光标记的是hsa-mir-21的核心片段，红色字体标记的是其上下游基因组序列
GTCGGGTCCAGCGATCTGCCATGACTCTCCCTCCACGCGCGTCCGGCCTGACATCGGCAGTTGGTCAGCGATGACGGCGCCGCCGATGGCGTCTGGACCACGCCCGAAGAGCGTCGAAGCGGGACGTGTTCGCCGAGATCGCTCGCGCCATGCCCGAGTGAGCCGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCTTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCTGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGAGTTTGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGGATCTTAACAGGCCAGAAATGCCTGGGTTTTTTTGGTTTGTTTTTGTTTTTGTTTTTTTATCAAATCCTGCCTGACTGTCTGCTTGTTTTGCCTACCATCGTGACATCTCCATGGCTGTACCACCTTGTCGGGTAGCTTATCAGACTGATGTTGACTGTTGAATCTCATGGCAACACCAGTCGATGGGCTGTCTGACATTTTGGTATCTTTCATCTGACCATCCATATCCAATGTTCTCATTTAAACATTACCCAGCATCATTGTTTATAATCAGAAACTCTGGTCCTTCTGTCTGGTGGCACTTAGGGATCCTGATCAGAATTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTAAATCACTTTTTTCAATTGGAAGACTAATGCGGCCGGCCATTACTCCGTCTCGTGTCTTGTTGCATATGTCTGCTGGTTTGTTTGATGTTGTTTGCGGGCGGGCCCTATAGTGAGTCGTATTACCTAGGACGCGTCTGGAACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTGTGAAAGATTTACCTGGAAA

五、 和元参考文献
1. F.M.奥斯伯等著，马学军等译，精编分子生物学实验指南（第四版），科学出版社
2. Scherr M, Venturini L, Eder M. Lentiviral vector-mediated expression of pre-miRNAs and antagomiRs.Methods Mol Biol. 2010;614:175-185.
3. Jia XQ, Cheng HQ, Qian X, et al. Lentivirus-mediated overexpression of microRNA-199a inhibits cell proliferation of human hepatocellular carcinoma. Cell Biochem Biophys. 2012 ;1: 237-244.