外泌体摄取实验

外泌体原理：外泌体是由细胞内多泡体与细胞膜融 合后，释放到细胞外基质中的膜性囊泡。几乎所有类型的细胞，都可以产生并释放外泌体。它是一种直径为30-150 nm的纳米级脂质包裹体结构，内部包裹了蛋白、mRNA和microRNA等物质。
 

外泌体功能：

抗原呈递、组织修复、肿瘤转移、神经退行性疾病、代谢重建等。
 

外泌体来源：

所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括脑脊液、唾液、肺泡灌洗液、乳汁、胆汁、尿液、血液、羊水等。
 

外泌体分离：

1、超速离心法：外泌体分离的金标准，是目前最常用的纯化方法，低速和高速交替进行。但由于这种方法需要昂贵的大型仪器，且步骤繁多、非常耗时，无法实现自动化；密度梯度离心法有着和差速离心法一样的问题，而且还需要额外的清洗步骤。

2、超滤法：截留不同相对分子质量的超滤膜进行选择性分离。在分离过程中，外泌体会堵塞滤孔，导致过滤效率降低，且在过滤中会产生剪切力导致外泌体破裂。对于血浆、血清等生物样本，由于其含杂质较多，限制了大体积样本在超滤法方面的应用。

3、聚合物沉淀法：当前实验室最常用的外泌体提取方法，但是这种方法提取的外泌体的纯度不高，沉淀中除了外泌体还会有很多包括脂蛋白在内的杂质，影响后续分析，且沉淀法涉及离心、重悬等操作，不利于自动化的进行，目前尚未有基于沉淀法的外必体提取自动化产品；

4、免疫亲和磁珠捕获法：外泌体表面标记物抗体的磁珠与外泌体孵育，即可分离外泌体。外泌体的活性收PH和盐浓度的影响，需要较深的技术积累和较好整合能力；

5、微流体芯片技术：缺点主要体现在成本高、且由于微流控的定义就是基于微小流体的技术，因此其对于大体积样本的处理能力很弱，一般仅适用于小体积样本的提取检测，部分新技术（外加电场和声波）对外泌体的影响尚有待检验。
 

外泌体鉴定：

1、电镜检测

透射电子显微镜观察法（TEM）观察外泌体形态和大小。利用负染，在高倍放大下观察外泌体的形态结构和大小。但是电镜会有背景的干扰（尤其血清血浆）。

2、粒径检测

从整体上对外泌体的大小的分布情况和颗粒浓度进行检测。复杂外泌体蛋白样不建议采用。

3、Western Blot检测

Western blot是采用抗原抗体特异性相结合的原理，对外泌体特有的标志物进行检测，从蛋白质层面对外泌体进行鉴定。常用的外泌体标志蛋白包括CD63、CD9、CD81、TSG101等。单是WB不稳定，有些指标出不来，复杂外泌体蛋白样不建议采用。
 

蛋白质组学分析：

1、标记定量蛋白组：iTRAQ/TMT

iTRAQ和TMT是目前应用较为广泛的蛋白质定量方法之一。两个方法的原理类似，都是化学体外标记方法。这两种方法可检测出低丰度的蛋白，胞外蛋白，膜蛋白，胞浆蛋白 等，可同时处理多个样本，鉴定和定量的结果同时得出且准确，适用比较蛋白组分析，鉴定差异蛋白。
 

SILAC

SILAC的基本原理是通过培养，利用天然同位素（轻型）或者稳定同位素（中型/重型）取代相应氨基酸。经过5-6次传代后，稳定同位素可以完全掺入到新合成的蛋白质中。不同标记的细胞或者蛋白等比例混合后，引入质谱鉴定。

SILAC的优点是蛋白标记效率高，传代6-8代后，灵敏性高。可检测水平低的蛋白含量变化和翻译后修饰，且样本需求量小，每个样本仅需几十微克，缺点是耗时长。
 

2、非标记定量蛋白组：Label free

非标记（Label free）蛋白质定量利用液质联用技术将蛋白质酶解形成多肽后进行质谱分析，通过计算蛋白肽段的鉴定数目和色谱峰面积进行蛋白质相对定量。该方法的优点是无需昂贵的标签做内标，且样本制作过程简单，由于操作步骤少，可尽量减少人为和系统误差。但是数据分析相对标记定量而言难度更大更复杂，且重复性较差，对仪器的稳定性和重复性要求高。通过在样本中添加已知含量的标准蛋白还可以实现绝 对定量。

DIA

DIA技术的原理是在质谱数据采集时，高速、循环的将每个采集窗口内的所有母离子及其碎裂后的子离子进行全扫描，而非根据母离子信号筛选后进行二级碎片再扫描。DIA相比于传统label free的最大的优势在于高效测定复杂样品中相对低丰度的蛋白分子，极大地增加了定量分析的可信度。
 

外泌体研究方向：

1、疾病诊断：疾病诊断和预后分子标志物，适用于液体活检。

2、疾病机制研究：适用于肿瘤、代谢、神经系统等疾病。

3、药物载体：具有免疫源性低、稳定性好、具有靶向性可跨越血脑屏障等作用。