外泌体WB鉴定

WB是一种常用的分离和鉴定蛋白质的技术。来分离指定样品中包含的各种蛋白质，

然后将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或PVDF膜上，

接下来将膜与目标蛋白质的特异性抗体一起孵育，并通过洗膜，将未结合的抗体洗掉，只留下与目标蛋白质结合的抗体，

最后通过显影胶片或荧光扫描来检测结合的抗体。

纳米流式
纳米流式是一种新方法，它可以从更高的分辨率来鉴定外泌体的粒径、浓度、纯度和标志物等。

流式细胞术（FCM）是对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和分选的技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。

但由于传统的流式细胞术主要针对细胞大小的生物粒子进行分析，所以分析外泌体我们通常使用的是升级后的纳米流式。

纳米颗粒跟踪分析技术
 

NTA是利用光散射和布朗运动的特性获得悬浮液中样本粒度分布的检测方法。

检测中通过光学显微镜，可直接观察纳米颗粒，收集纳米颗粒的散射光信号，跟踪其布朗运动轨迹，对复杂样品具有极高的分辨率。

该方法能保证外泌体原始状态，检测速度快、检测后能提供外泌体粒径和浓度信息。但它的灵敏度是70nm,且会把外泌体表面的水膜也检入，所以检出外泌体的粒径会比实际的偏大。

透射电镜TEM
 

透射电镜把经加速和聚集的电子束投射到非常薄的样品上，电子与样品中的原子碰撞而改变方向，从而产生立体角散射。

散射角的大小与样品的密度、厚度相关，因此可以形成明暗不同的影像。透射电子显微镜的分辨率为0.1～0.2nm，放大倍数为几万～百万倍， 用于观察超微结构，即小于0.2µm、光学显微镜下无法看清的结构，又称“亚显微结构”。

外泌体的鉴定

国际囊泡协会（MISEV2018）规定了外泌体鉴定的最小实验要求，包括

1） 总体表征：至少3个阳性蛋白（至少包括1个跨膜蛋白和1个细胞溶质蛋白）和1个阴性蛋白标志物。

外泌体阳性蛋白标志物可选择跨膜蛋白CD9、CD63、CD81，以及溶质蛋白TSG101、Alix、HSP70。

外泌体阴性蛋白标志物可选择内质网蛋白Calnexin、细胞核蛋白histone 3或高尔基体蛋白GM130。

细胞外囊泡根据其产生方式不同和粒径大小不同，可分为外泌体、微囊泡和凋亡小体。外泌体是一种30-150nm的细胞外囊泡，参与人体细胞的许多生理活动。来源于癌细胞的外泌体在临床诊断、早期肿瘤检测和分子治疗靶点识别等方面具有巨大的应用潜力。
细胞外囊泡包括外泌体、微囊泡和凋亡小体，其中外泌体具有许多生理作用，并具有在临床诊断、早期肿瘤检测和分子治疗靶点识别等方面的应用潜力。外泌体的鉴定方法包括总体表征和个体表征，其中总体表征包括至少3个阳性蛋白和1个阴性蛋白标志物，而个体表征则包括电镜和NTA等方法。流式细胞术是一种新方法，可用于鉴定外泌体的粒径、浓度、纯度和标志物等。