1.了解并掌握差速离心技术分离细胞器的一般原理和方法

2.观察线粒体形态特征和活性

 

1、在一定的离心场中(选用离心机的一定转速)，球心颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀的悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部,从而分批收集。细胞器沉降先后顺序先后是细胞核／叶绿体、线粒体、溶酶体和其它微体、核糖体和大分子。

2、詹纳斯绿，氧化状态呈现蓝绿色，还原状态为无色。线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态，呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料为无色。

 

实验材料

   

1. 材料 

    玉米黄化幼苗

2. 器材 

    离心机、天平、研钵、烧杯、离心管、荧光显微镜、载玻片、盖玻      片、滤纸、移液管

3. 试剂

    （1）0.25 mol/L蔗糖-提取缓冲液 

    （2）1%詹纳斯绿B(Janus green B)染液

    （3）0.3 M甘露醇溶液

线粒体作为细胞中非常重要的细胞器，从19世纪50年代末开始被科学家们广泛关注并展开研究
 

近年来的研究表明，线粒体与肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病、糖尿病、免疫性疾病等众多疾病的发生息息相关，它可以通过多种机制控制细胞，如细胞凋亡、细胞焦亡、坏死性凋亡、氧化应激、线粒体自噬、衰老、炎症等。

也正是与这些“热点”研究交叉，线粒体相关国家自然科学基金的中标数量近二十年稳步增加，从2022年国自然医学部的中标数目来看，线粒体方向共中标数更是位列第三，妥妥的“科学宠儿”！
 

Mouse liver 线粒体样本提取案例

一、Mouse liver线粒体分离

1）实验准备：提前将线粒体分离及蛋白提取试剂盒（Proteintech, PK10016）中溶液室温解冻，解冻后放置于冰上；4℃预冷离心机；预冷玻璃匀浆器。

2）取新鲜的小鼠肝脏组织（避开胆囊区域），用冰的PBS洗净肝脏组织块上附着的脂肪和血液等杂质，用滤纸吸干水分后称取1g组织样本转移至离心管中。

3）在冰上将离心管中的肝脏组织块剪碎，然后加入10ml预冷的线粒体分离试剂A。

4）样品匀浆：将样品悬液转移到10ml的预冷玻璃匀浆器中，在冰浴条件下对样品匀浆10次

破碎效果鉴定：取20ul组织匀浆液，加入等体积的0.4%台盼蓝溶液，混匀；在显微镜下观察台盼蓝溶液染色阳性（蓝色）细胞数目的比例，此时阳性（蓝色）细胞破碎已达到60%即可停止匀浆。

 

6）线粒体粗分离：将肝脏匀浆液平分成2管，每管5ml，各取5ml的线粒体分离试剂B分别加至2个新的离心管底部，然后沿管壁缓慢地加肝脏匀浆液使其覆盖于上层；4℃，700g离心10min，线粒体组分存在于上层分离层中。

收集最上层分离层，将收集的上层分离液转移至新的1.5ml EP管中，每管1 ml；4℃，10000g离心10min，收集沉淀；收集得到的沉淀即为粗线粒体。

 

7）高纯度线粒体分离：取4.25ml线粒体分离液C和0.75ml线粒体分离液D配制成高纯度线粒体分离液，按照0.5ml每管（1.5ml EP管）提前加入新的EP管中；将粗线粒体沉淀每管加入0.5ml的线粒体洗涤液重悬，将重悬的粗线粒体缓慢的加入到高纯度线粒体分离液的上层；4℃，22000g离心10min，收集沉淀；每管沉淀加入1ml的线粒体洗涤液重悬沉淀，4℃，16000g离心5min，收集沉淀；收集到的沉淀为高纯度的线粒体。