双荧光素酶实验

提供商 ：武汉

服务名称 ：武汉傲星生物科技有限公司

实验概念
将目的基因转录调控原件构建入带有荧光素酶(Firefly luciferase)的表达载体，构建成报告基因质粒，使这段序列调控luciferase的转录表达。然后将报告基因质粒转染细胞，给予其不同的处理后裂解细胞，并加入底物荧光素(luciferin)，luciferase可催化luciferin发出荧光(最强波长在560nm左右)。检测得到的荧光值高低可以判断不同处理组对该转录调控原件的影响。为避免由于质粒转染细胞时效率差异所造成的误差，通常会转入Renilla luciferase的报告基因质粒作为内参(最强波长在465nm左右)，即双荧光报告系统。

 

实验流程

（1） 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。
（2）设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（pGL3-basic）中。
（3）筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。
（4） 扩增转录因子质粒，提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照，提纯备用。
（5） 培养293（或其它目的细胞），并接种于24孔板中，生长10-24小时（80%汇合度）。
（6） 将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。
（7）提取蛋白并用于荧光素酶检测。
（8） 加入底物，测定荧光素酶的活性。
（9） 计算相对荧光强度，并与空载对照比较。

注意事项：需提前告知相关的基因信息，如名称、序列、ID等