文献支持超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒（WST-1法） 微量法

保存条件 ：2-8°C

保质期 ：6个月

英文名 ：Superoxide Dismutase（SOD）Activity Assay Kit （WST-1 Method）

库存 ：999

供应商 ：北京索莱宝科技有限公司

CAS号 ：BC5165-100T/48S

规格 ：100T/48S

超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒（WST-1法）说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC5165

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：使用前先使用掌上离心机离心至管底再吹打混匀；

2、 试剂二工作液：根据样本数量按试剂二：蒸馏水=5μL：245μL（共250μL，约12S）的比例配制试剂二工作液，现用现配；

3、 试剂四工作液：根据样本量按试剂四：蒸馏水=20μL：180μL（共200μL，约20T）的比例配制试剂四工作液，现用现配。

产品说明：

SOD（EC 1.15.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化超氧化物阴离子发生歧化作用，生成H₂O₂和O₂。SOD不仅是超氧化物阴离子清除酶，也是H₂O₂主要生成酶，在生物抗氧化系统中具有重要作用。

通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子(O₂^-)，O₂^-可与WST-1反应生成水溶性黄色甲臜，后者在450nm处有吸收峰；SOD可清除O₂^-，从而抑制了甲臜的形成；反应液黄色越深，说明SOD活性愈低，反之活性越高。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、电子天平、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 细菌或培养细胞样本：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）=500-1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液）超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次），8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2. 组织样本：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1:5-10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3. 血清（浆）样本：直接检测，若有浑浊可离心后取上清进行测定。

二、测定步骤

1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至450nm，分光光度计蒸馏水调零。

2. 测定前将试剂一、试剂三和试剂四工作液37℃水浴5min以上。

3. 加样表（按顺序在EP管或96孔板中加入下列试剂）

充分混匀，37℃水浴30min后，450nm处测定各管吸光值A。分别记为A测定、A对照、A1空白、A2空白，计算ΔA测定=A测定-A对照，ΔA空白=A1空白-A2空白。（空白管1和空白管2各只需做1~2管；每个样本有一个对照管）

三、SOD活性计算

1、抑制百分率的计算

抑制百分率=(ΔA空白-ΔA测定) ÷ΔA空白×100%

尽量使样本的抑制百分率在30-70%范围内，越靠近50%越准确。如果计算出来的抑制百分率小于30%或大于70%，则通常需要调整加样量后重新测定。如果测定出来的抑制百分率偏高，则需适当稀释样本；如果测定出来的抑制百分率偏低，则需重新准备浓度比较高的待测样本或者提高加样表中的样本量，但需相应减少测定管和对照管中蒸馏水的体积。

2、SOD酶活性单位：在上述黄嘌呤氧化酶偶联反应体系中抑制百分率为50%时，反应体系中的SOD酶活力定义为一个酶活力单位。

3、SOD酶活性计算：

（1）血清（浆）SOD活性（U/mL）=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反总] ÷V样×F

=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ×F

（2）组织、细菌或培养细胞SOD活力计算：

a.按样本蛋白浓度计算

SOD活性（U/mg prot）=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反总] ÷(V样×Cpr)×F

=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷Cpr×F

b.按样本质量计算

SOD活性（U/g 质量）=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反总] ÷(W×V样÷V样总)×F

=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F

c.按细菌或细胞数量计算

SOD 活力（U/10⁴ cell）=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反总] ÷(N×V样÷V样总)×F

=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷N×F

V反总：反应总体积，0.2mL；V样：加入反应体系中的样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积1mL；Cpr：蛋白样本浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细胞或细菌总数，以10⁴计；F：样本稀释倍数。

注意事项：

1、 样本和试剂二工作液使用时在冰上放置。

2、 样本较多时，可按表格配制测定管工作液和对照管工作液（包含试剂一、（试剂二工作液）、试剂三、蒸馏水），试剂四工作液必须最后加入。

实验实例：

1、 取0.1g大鼠肝脏加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清稀释50倍，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算ΔA测定= A测定-A对照=0.419-0.047=0.372，ΔA空白=A1空白-A2空白=0.752-0.045=0.707，抑制百分率=(ΔA空白-ΔA测定) ÷ΔA空白×100%=47.38%，按样本质量计算酶活得：

SOD活性（U/g 质量）=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F =4502.09 U/g 质量。

2、 取0.1g绿萝叶片加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清稀释3倍，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算ΔA测定= A测定-A对照=0.417-0.108=0.309，ΔA空白=A1空白-A2空白=0.752-0.045=0.707，抑制百分率=(ΔA空白-ΔA测定) ÷ΔA空白×100%=56.29%，按样本质量计算酶活得：

SOD活性（U/g 质量）=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F =386.34 U/g 质量。

3、 450×10⁴个Hela细胞，加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清按照测定步骤操作，用96孔板测得计算ΔA测定= A测定-A对照=0.417-0.053=0.364，ΔA空白=A1空白-A2空白=0.752-0.045=0.707，抑制百分率=(ΔA空白-ΔA测定) ÷ΔA空白×100%=48.51%，按细胞数量计算酶活得：

SOD活性（U/10⁴ cell）=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷N×F =0.021 U/10⁴ cell。

4、 取50μL人血清按照测定步骤操作（同时减少加样表中蒸馏水体积），用96孔板测得计算ΔA测定= A测定-A对照=0.889-0.418=0.471，ΔA空白=A1空白-A2空白=0.752-0.045=0.707，抑制百分率=(ΔA空白-ΔA测定) ÷ΔA空白×100%=33.38%，按血清（浆）体积计算酶活得：

血清（浆）SOD活性（U/mL）=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反总] ÷V样×F =2.004 U/mL

参考文献：

[1] Peskin A V, Winterbourn C C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1) [J]. Clinica chimica acta, 2000, 293(1-2):157-166.

[2] Hou Z, Zhao L, Wang Y, et al. Purification and characterization of superoxide dismutases from sea buckthorn and chestnut rose[J]. Journal of food science, 2019, 84(4): 746-753.

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