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文献和实验
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库存 :80
英文名 :Genmfast One Step Probe RT-qPCR Kit
保质期 :一年
供应商 :杭州格巨医学科技有限公司
保存条件 :-20℃避光保存
规格 :50 RXN (20 μL 体系/RXN)
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 |
Genmfast One Step Probe RT-qPCR Kit | SR31051 | 50 RXN (20 μL/RXN) |
Genmfast One Step Probe RT-qPCR Kit | SR31052 | 200 RXN (20 μL/RXN) |
Genmfast One Step Probe RT-qPCR Kit是采用探针法进行 RT-qPCR反应的通用款试剂盒。本试剂盒以RNA为模板,使用基因特异引物,逆转录和PCR应可在同一管内连续进行,不需要额外的开管、移液等操作,简化了实验操作,降低了污染的风险。本反应体系可以对扩增产物进行实时检测,大大提高了检测灵敏度,并且省略了PCR反应后的电泳步骤,非常适合于RNA病毒等微量RNA的检测。
本试剂盒以RNA为模板,使用基因特异性引物,利用新型耐热Reverse Transcriptase 高效合成第一链cDNA,并搭配使用探针和高效 HotStart Taq DNA Polymerase,配合经过优化的缓冲体系,具有高扩增效率和高扩增灵敏性,能稳定高效的进行一步法RT-qPCR反应。
产品组分
组分 | 50 RXN (20 μL/RXN) | 200RXN (20 μL/RXN) |
2x One Step RT-qPCR Buffer | 500 μL | 2×1 mL |
One Step Enzyme mix | 100 μL | 400 μL |
50 X High ROX | 20 μL | 80 μL |
50 X Low ROX | 20 μL | 80 μL |
ddH2O(Nuclease Free) | 500 μL | 2×1 mL |
High Rox 适用机型:ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™
Low Rox 适用机型:ABI 7500, 7500 Fast, ViiA™7, QuantStudio™ 3 and 5, QuantStudio™ 6,7,12k Flex
Stratagene MX3000P™, MX3005P™, MX4000P™
不需要 Rox 校正的仪器型号:
Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon ®, Opticon ®2, Chromo4™ Eppendorf Mastercycler® ep realplex, realplex 2 s; Qiagen Corbett Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 3000, Rotor-Gene® 6000 Roche Applied Science LightCycler® 480, LightCycler® 2.0; Lightcycler® 96 Thermo Scientific PikoReal Cycler; Cepheid SmartCycler®; Illumina Eco qPCR
运输和保存方法
冰袋运输。-20℃避光保存,有效期 1 年。本品避免反复冻融。建议分装保存。
注意事项
1. 使用 2xOne Step RT-qPCR Buffer 时,请充分融解,混匀后使用,避免强光直射。若同时需要配制多个 One Step RT-qPCR 反应时,应配制各种试剂的混合液,然后再分装到每个反应管,减少试剂损失。
2. 试剂盒中的 One Step Enzyme mix含有高浓度甘油,在使用前请轻轻混匀,避免起泡;分取之前请瞬时离心收集到管底后使用,使用后立即放回-20℃冰箱保存。
3. 反应液的配制和分装一定使用无污染的枪头、Microtube,尽量避免污染。
4. 为保证反应的成功,建议使用高质量的RNA模板。
5. 本试剂盒只能使用特异性引物,不能使用随机引物或Oligo dT引物等进行反转录反应。
6. 一步法 RT-qPCR 实验设计用于扩增的引物时,推荐扩增产物长度在70~200 bp,效果最佳。
操作说明
实验准备:
l 1.5 mL RNase-free EP 管、RNase-free PCR 管、移液器和枪头、冰盒或冰。
l PCR 探针、引物与模板。
l 荧光定量 PCR 专用管或平板。
实验方法:
用户需自备的试剂:RNA 模板、引物、探针。请按照不同品牌
荧光定量 PCR 仪的使用说明书要求进行实验操作。
1. 配制 One Step RT-qPCR 反应体系:
推荐冰上配制反应体系,以 20μL 反应体系为例:
组分 | 加入体积 | 加入体积 |
2x One Step RT-qPCR Buffer | 10 μL | 25 μL |
One Step Enzyme mix | 2 μL | 5 μL |
正向引物(10 μM) * | 0.4 μL | 1 μL |
反向引物(10 μM) | 0.4 μL | 1 μL |
TaqMan Probe (10 μM) | 0.4 μL | 1 μL |
50×High Rox or Low Rox | 0.4 μL | 1 μL |
模板 RNA | Total RNA: 1 pg-1 µg | Total RNA: 1 pg-1 µg |
ddH2O(Nuclease Free) | to 20 μL | to 50 μL |
b 引物浓度:通常引物终浓度为 0.2 μM,也可以根据情况在 0.1-1.0 μM 之间进行调整。
c 探针浓度:探针终浓度可在 50 nM-250 nM 之间调整。
d 模板稀释:建议在20μL的体系中加入10 pg~100 ng的Total RNA为模板。
2. 推荐的 One Step RT-qPCR 反应程序:
反应阶段 | 温度 | 时间 | 循环数 | |
1 | 逆转录 | 50℃ | 10 min | 1 |
2 | 预变性 | 95℃ | 3 min | 1 |
3 | 循环反应 | 95℃ | 10 sec | 42 |
60℃ | 30~40 sec |
【注】: a 对于含复杂二级结构或高 GC含量的 RNA 模板,可将逆转录温度提高到 55℃,有助于提升扩增效率和灵敏度。
b 逆转录时间可以根据模板的复杂程度进行调整,时间为 10 min 时可满足大多数基因的鉴定。
c 不同的qPCR 检测仪器所需的荧光信号采集时间不同,请根据最短时间限制进行设置。
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