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文献和实验
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库存 :20
保质期 :12 个月
供应商 :上海西格
保存条件 :2-8°C
规格 :100反应/250反应 /500反应
PCR反应条件优化:
1、变性温度和时间:
一步染料法RT-qPCR试剂盒保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s,再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长,可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。
2、复性温度和时间:
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高,产物特异性越高。复性温度越低,产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。
3、延伸温度和时间:
一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时,过高的延伸温度不利于引物与模板的结合,可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间,可根据待扩增片段的长度而定,小于1kb, 1min足够;大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意,延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。
4、循环数:
其他参数选定后,PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后,PCR产物的积累即可达到最大值,实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%,因此不管模板浓度是多少,20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多,非特异扩增增加。
货号 | 产品名称 | 规格 |
XG-P3133 | 一步染料法RT-qPCR试剂盒 | 100反应 |
XG-P3133 | 一步染料法RT-qPCR试剂盒 | 250反应 |
XG-P3133 | 一步染料法RT-qPCR试剂盒 | 500反应 |
降落PCR与温度梯度PCR都是对反应体系中的退火温度进行优化,但两者在原理上有所不同。
温度梯度PCR是为了找到最适的退火温度,设置不同的退火温度进行多管PCR,将其分别放置在PCR仪中的不同温度模块进行反应,最终找到最适的退火温度,并进一步以此退火温度进行普通PCR扩增。
降落PCR是为了提高反应的特异性,通过设计一系列不断降低的退火温度,在同一PCR管内进行PCR扩增,最终获得大量的特异性扩增产物。
与温度梯度PCR相比,降落PCR更有优势。温度梯度PCR需要多次反应或多管反应找到最适的退火温度,之后还需以找到的最适退火温度再次进行PCR,才能得到较好的扩增效果,操作比较繁琐。降落PCR只需一次反应就可以获得很好的扩增效果,避免了对每对引物进行最适退火温度的优化和测定工作。
降落PCR适用于不确定引物的最适Tm值,或引物扩增效果不佳时,不了解目的模板同源性程度,使用降落PCR可以快速、特异的得到目的扩增片段。根据不同实验的需要,降落PCR还可与其它PCR方法同时使用,如实时定量降落PCR、竞争降落PCR等。
PCR的特点:
特异性强:使用两对引物进行扩增提高了特异性,第一轮PCR中由外引物错配产生非特异性产物,同时在第二轮PCR中内引物与错误片段配对扩增的概率极低,降低了扩增多个靶位点的可能性。
灵敏度高:进行两轮PCR扩增,可以执行更多的循环,从低拷贝样本中扩增得到足量的产物,克服了单次扩增平台期限制,提高PCR的灵敏度。
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